王濤，姚韜，李濤，游玲，周瑞平，王松，馮瑞章

1(宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓，644000)

2(宜賓學院發(fā)酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川宜賓，644000)3(宜賓敘府酒業(yè)有限公司，四川宜賓，644000)

濃香型白酒中含量和比例協(xié)調、穩(wěn)定的呈香呈味物質主要由窖內發(fā)酵體系中微生物群落共同代謝產生。盡管受限于分析檢測手段和風味化學技術，目前尚無法充分解析濃香型白酒中復雜的呈香呈味物質，但己酸乙酯已被確定為濃香型白酒的主體呈香呈味物質［1］。目前，行業(yè)采用多種方法來提高濃香型白酒原酒中己酸乙酯的含量［2-4］，其中利用高產酯化酶的霉菌和酵母強化制曲以及促進黃水、酒尾的窖外酯化是主要手段［2，5］。盡管目前已從濃香型白酒釀造環(huán)節(jié)中分離得到了一些具有較強酯化酶活性的菌株［6-7］，但對于這些菌株產酯化酶或酯化能力的研究均是在脫離發(fā)酵糟醅的情況下開展的，與生產實際差異較大。

系統(tǒng)地研究濃香型白酒釀造環(huán)境中酵母菌區(qū)系對發(fā)酵糟醅中己酸乙酯濃度的影響，可以在一定程度上揭示釀造環(huán)境中的酵母區(qū)系與發(fā)酵糟醅中生物和非生物因子的互作關系，為探究釀造環(huán)境中的酵母區(qū)系在濃香型白酒釀造中的作用，進而闡明釀造環(huán)境對濃香型白酒釀造的重要作用，揭示濃香型白酒發(fā)酵機理、改進生產提供依據;這些菌株也是一類潛在的生物資源，具有潛在的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

2008年以來分離自濃香型白酒生產企業(yè)釀造諸環(huán)節(jié)，通過菌落和細胞表觀特征去除了冗余的122株酵母，經多次純化保存于發(fā)酵資源與應用四川省高校重點實驗室。其中糟醅62株、窖房38株、曲房16株、窖泥4株、曲藥2株。

1.1.2 培養(yǎng)基和入窖糟醅

培養(yǎng)基:YPD固體和液體培養(yǎng)基。

入窖糧糟:2011年4月采自四川宜賓某知名酒企的多糧濃香型入窖糧糟(“跑窖法”工藝，添加了20%曲粉)。

1.1.3 主要儀器及試劑

PCR儀為Bio-Rad公司產品;菌株DNA提取、26S rDNA D1/D2區(qū)片段擴增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為上海生物工程技術服務有限公司(Sangon)產品;其余試劑除己酸乙酯標樣為色譜純外，均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌活化

YPD培養(yǎng)基活化并培養(yǎng)后，無菌水調整濃度為108個/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接種與發(fā)酵

在釀造車間內將入窖糧糟和原窖黃水裝入無菌500 mL三角瓶中(每瓶400 g糟醅和10 mL黃水)，再接種酵母菌懸液10 mL(每個處理設1個重復;不接種酵母菌懸液為空白對照)，橡膠塞及保鮮膜封口后遮光發(fā)酵75 d(發(fā)酵時間為4月～6月)，室內溫度采用空調控制在28℃，同批次入窖糧糟正常入窖發(fā)酵(75 d)的中下層糟醅多點(距窖壁及窖底不同距離)取樣，等重量混合作為窖內對照。

1.2.3 發(fā)酵糟醅中己酸乙酯檢測

每個三角瓶取糟醅200 g，窖內對照取樣1 000 g，按照體積比為1∶1加入蒸餾水蒸餾，取餾分100 mL，0.22 μm細菌濾膜過濾后進行 GC-MS檢測(島津GCMS-QP2010PLUS)，測定各樣品中己酸乙酯和乙醇濃度(以1.698 7 g/L的己酸乙酯溶液對餾分中己酸乙酯濃度進行確認)。其中，窖內對照糟醅窖內多點取樣混合;三角瓶中糟醅混勻后再取樣，每個處理單獨檢測后取平均值。

色譜條件:色譜柱為LZP-930(30 m×0.32 mm×1.00 μm)毛細管柱，載氣為高純氦氣，柱溫50℃(保持3 min)，以5℃/min的速率升溫至150℃(保持5 min);以5℃/min的速率升溫至190℃(保持5 min)，以3℃/min的速率升溫至220℃(保持10 min);進樣口溫度220℃，進樣量0.2 μL，分流比30∶1。

質譜條件:電離源EI，電子能量70 eV;離子源溫度200℃，檢測溫度240℃，溶劑延遲3 min，掃描范圍30～550 amu，倍增電壓1.2 kV。

1.2.4 促進糟醅高產己酸乙酯菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

對能夠促進糟醅中己酸乙酯含量高于窖內對照的酵母開展形態(tài)、生理生化鑒定［8］。并根據文獻［9-10］獲得菌株的26S rDNA D1/D2片段，上海生物工程技術服務有限公司(Sangon)完成測序并獲得GenBank序列號(具體見文中“圖1”)，序列已上傳至測得序列經校正后在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索(BLAST search)，用ClustalX按照最大同源性的原則進行比對，采用Kimura-2［11］計算相似值，并用BioEdit 5.0.9進行檢驗;采用Mega 4.0進行系統(tǒng)進化樹的構建、編輯與保存。

1.2.5 促進糟醅高產己酸乙酯菌株的耐受性檢測

參照文獻［12］分別檢測菌株的7%、10%乙醇(V/V)，pH 3.0、3.5 和35℃、38℃條件下的生長情況。

2 結果與分析

2.1 糟醅發(fā)酵情況

三角瓶中的糟醅發(fā)酵結束時呈潤濕、均一的泥黃色，整體發(fā)酵情況良好，發(fā)酵過程中沒有出現霉菌污染情況。經發(fā)酵過程監(jiān)控和出窖后原酒檢測，窖內發(fā)酵糟醅發(fā)酵正常。

2.2 各個糟醅樣品中己酸乙酯含量

經GC-MS檢測，空白對照和窖內對照己酸乙酯的濃度分別為0.13 g/L和2.46 g/L;乙醇濃度分別為55.21 g/L和54.28 g/L，其中窖內對照中己酸乙酯和乙醇濃度與采樣企業(yè)生產的實際情況基本一致，也表明本研究中所采用的入窖糧糟及窖內發(fā)酵過程正常。空白對照中己酸乙酯濃度遠低于窖內對照，顯示窖池(窖泥)對于濃香型白酒原酒中己酸乙酯的生成具有重要作用。

接種了酵母的糟醅的己酸乙酯濃度遠高于空白對照，達到了0.78 g/L。超過50%的供試菌株(73株，占59.84%)可以促進發(fā)酵糟醅中己酸乙酯高于空白對照，其中還有8株酵母高于窖內對照。接種了Z8Y-13(分離自窖房空氣)的糟醅中己酸乙酯濃度達到了7.50 g/L，分別為空白對照和窖內對照高57.69倍和3.05倍，在所有樣品中最高;而接種了Z4Y-31菌株(分離自糟醅)的糟醅最低(0.03 g/L)，僅分別為空白對照和窖內對照的23.08%和1.22%。這表明釀造環(huán)境中的酵母區(qū)系對糟醅中己酸乙酯生成具有重要作用;除超過半數的菌株可以促進己酸乙酯生成外，也有相當數量的酵母菌株可能會抑制己酸乙酯生成或降解(利用)己酸乙酯。這也在一定程度上體現了自然接種的固態(tài)發(fā)酵體系這個“黑箱”(Black box)［13］中微生物之間、微生物與環(huán)境因子之間復雜的互作關系。

2.3 不同分離來源的酵母促進(抑制)糟醅產己酸乙酯的情況

從不同釀造環(huán)節(jié)分離得到的酵母對應糟醅中己酸乙酯和乙醇濃度如表1。

表1 不同釀造環(huán)節(jié)的酵母促進(抑制)糟醅產己酸乙酯的情況Table 1 The statue of the yeasts in promoting(inhibit)caproic acid ethyl ester generating isolated from different brewing stage

從表1可以看出，各樣點酵母對應糟醅中乙醇平均濃度均與窖內和空白對照接近，表明這些樣品發(fā)酵總體正常。能促進糟醅產己酸乙酯的73株酵母分離自濃香型白酒釀造的各個環(huán)節(jié)。其中糟醅(33株)、窖房空氣(23株)、曲房空氣(12株)、窖泥(3株)和曲藥(2株)，分別占各樣點酵母數的 53.22%、60.53%、75.00%、75.00%和100.00%。這表明在濃香型白酒釀造各個環(huán)節(jié)均存在能夠促進糟醅產己酸乙酯的酵母菌。

從能夠促進己酸乙酯濃度增加的酵母的絕對數量看，發(fā)酵糟醅的最多，曲藥最少;但從這些菌株在各自樣點供試菌株中所占比例來看，情況剛好相反。這不僅從另一個側面證實了大曲對于濃香型白酒生產的重要性及制曲過程是對曲藥中功能酵母的定向選擇過程，還在一定程度上顯示了濃香型白發(fā)酵糟醅中微生物功能的協(xié)調性(糟醅中抑制或降解己酸乙酯的菌株的相對數量和絕對數量均為最高)。

不同樣點的酵母所對應的糟醅中己酸乙酯平均濃度分別為:窖房空氣0.97 g/L，窖泥0.75 g/L，糟醅0.73 g/L，曲房空氣0.57 g/L，曲藥0.36 g/L。從己酸乙酯平均濃度和能夠顯著提高己酸乙酯含量(高于窖內對照)的酵母數量來看，分離自曲房空氣和曲藥的酵母明顯低于另3個樣點;這在一定程度上顯示窖房生產環(huán)境中(窖房空氣、窖泥、糟醅)的酵母區(qū)系促進糟醅中己酸乙酯含量增加的能力更強。

此外，無論從能夠大幅度促進糟醅中己酸乙酯含量的菌株數量還是對應糟醅中己酸乙酯濃度，窖房空氣都要顯著高于曲房空氣，這表明窖房空氣中的酵母菌區(qū)系促進糟醅產生己酸乙酯能力要高于曲房空氣。這為濃香型白酒行業(yè)中關于“長期的發(fā)酵生產對環(huán)境中的微生物區(qū)系進行了定向選擇”的推論提供了一定的理論依據。

2.4 8株酵母的鑒定及其對釀造環(huán)境的適應性

使糟醅中己酸乙酯濃度高于窖內對照的8株菌基于26S rDNA D1/D2區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育分析如表2和圖1，對乙醇、高酸和溫度的耐受如表3。

表2 8株酵母的同源性分析Table 2 Homology analysis of 8 yeast strains

圖1 基于26S rDNA D1/D2序列繪制的8株酵母的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Dendrogram tree of the 8 yeast strains based on D1/D2 sequences

從表2可以看出，8株酵母中有3株對應的糟醅 中己酸乙酯濃度略高于窖內對照，但有3株比窖內對照高出近1倍。同時，從8株酵母糟醅中乙醇濃度來看，發(fā)酵均正常。

按目前酵母菌的分類標準［14-15］，菌株D1/D2區(qū)序列相似性在99%以上且有形態(tài)特征支持時，可歸為一個種。結合表2、圖1和菌株形態(tài)、生理生化特征(結果略)，8株酵母分屬于Zygosaccharomyces bailii(1株)、Trichosporon coremiiforme(1株)、Issatchenkia orientalis(2株)、Debaryomyces hansenii(4株)等4種。

表3 8株酵母對乙醇、高酸和溫度的耐受Table 3 Tolerance of 8 yeast strains to alcohol，acid and temperature

通常情況下，窖內的主發(fā)酵結束后乙醇濃度在4.0% ～8.0%(31.58～63.14 g/L)，pH值下降至約3.2，最高溫度在35℃［16-18］。122株酵母中促進己酸乙酯生成有5株能夠在含有7%(V/V)濃度及以上的培養(yǎng)基中生長，其中的2株還能夠在10%(V/V)的條件下生長;有7株菌能夠耐受pH值為3.0的生長環(huán)境;7株菌能在35℃的培養(yǎng)條件下生長，其中4株能夠在38℃的條件下生長。這表明這些菌株很可能能夠在窖內發(fā)酵的后期生存并發(fā)揮作用，同時也顯示這些菌株中的大部分具有在窖內(外)應用的潛力。

3 討論

本研究結果顯示濃香型白酒釀造相關酵母對于己酸乙酯生成具有重要作用。超過一半的酵母可以促進發(fā)酵糟醅產生乙酸乙酯，而且這些酵母來自濃香型白酒釀造的各個環(huán)節(jié);發(fā)酵車間酵母區(qū)系促進糟醅己酸乙酯生產能力明顯強于制曲車間;分屬于4個種的8株酵母，能夠使窖外發(fā)酵的糟醅中的己酸乙酯高于窖內發(fā)酵糟醅，且這些菌株大多數能夠耐受窖內的高酸、高醇環(huán)境，具有生產應用前景。

目前已發(fā)現酵母酯類化合物的生物合成途徑存在酯化反應(脂肪酶/酯酶)、醇解反應(醇?；D移酶)和脫氫反應(醇脫氫酶)等3種途徑［19］。由于對濃香型白酒釀造體系中酵母產己酸乙酯的機理研究開展極少，目前還普遍認為其依賴需要過量乙醇和己酸的“乙醇與乙酸結合而成丁酸，再由丁酸結合乙醇而成為己酸，再經過酯化生成己酸乙酯［1］”途徑。本研究中，三角瓶發(fā)酵體系中雖然也具備了高產乙醇和己酸的條件(發(fā)酵糟醅為添加了曲粉的入窖糧糟;添加了少量原窖黃水以接種部分產己酸窖泥微生物)，而且確實也能夠高產乙醇。但己酸乙酯比窖內對照高出近2倍的糟醅樣品中的乙醇濃度濃度卻僅略高于窖內對照(見表3)，這顯示濃香型白酒發(fā)酵體系中很可能存在除酯化反應以外己酸乙酯生成途徑。

此外，3個樣點的酵母、8株己酸乙酯高產酵母中的6株所對應糟醅中的乙醇濃度均大于窖內對照;3株酵母糟醅中乙醇濃度大于7%(濃度換算成體積分數)卻不能耐受YPD培養(yǎng)基中7%乙醇濃度。這些不僅顯示濃香型白酒釀造環(huán)境中存在大量能夠促進發(fā)酵糟醅產生乙醇的酵母，還表明發(fā)酵糟醅中微生物存在密切的協(xié)同作用，而這些與我們原來的相關研究結果是一致的［20］。

相對于以往研究而言，以添加了大曲的入窖糧糟為培養(yǎng)基，并通過加入對照窖池原窖黃水的形式接種了部分窖泥微生物，使本研究盡可能地模擬了窖內發(fā)酵，結果更加接近生產實際，但緣于濃香型白酒發(fā)酵體系的復雜性和體積、溫度等發(fā)酵參數的差異，三角瓶和窖內2個發(fā)酵體系還是存在較大的差異。本研究雖然在一定程度上證實酵母對于己酸乙酯和乙醇的生成具有重要作用，但也顯示了濃香型白酒發(fā)酵體系的復雜性，有待于長期、系統(tǒng)的研究。

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