熊曉輝，李星，孫蕓，陸利霞

(南京工業(yè)大學食品與輕工學院，江蘇南京，211800)

大蒜(Alium sativaml)為百合科蔥屬多年生草本植物，大蒜具有多種生物活性功能，其廣泛的生理功能已被眾多學者所研究。大蒜經(jīng)組織受損或破碎后，蒜氨酸在蒜氨酸酶的作用下會產(chǎn)生硫代亞磺酸酯，硫代亞磺酸酯性質(zhì)不穩(wěn)定，在后續(xù)加工及貯存過程中進一步發(fā)生多種分解轉(zhuǎn)化反應(yīng)，形成多種有機硫化物。其中已報道過的大蒜功能特性有廣譜抗菌、抗病毒、提高機體免疫機能、抑制腫瘤、維持和保護肝臟的整體功能、治療心血管疾病等［1-3］，大蒜的這些活性功能與硫代亞磺酸酯和分解轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的有機硫化物是分不開的。硫代亞磺酸酯的提取一般采用溶劑浸提法，這種方法條件比較溫和，對硫代亞磺酸酯的破壞較少，本文研究了乙醇提取過程中各因素對硫代亞磺酸酯提取量的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了大蒜中硫代亞磺酸酯的提取工藝，并對其穩(wěn)定性及提取液貯存過程中有機硫化物轉(zhuǎn)化情況進行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

大蒜:江蘇浦口區(qū)蘇果超市售，95%乙醇，DTNB，L-半胱氨酸，Hepes緩沖液，DAS、DADS 和 DATS 標準品(純度≥95%，上海江萊生物科技有限公司)，其他試劑均為分析純。

組織搗碎機，RE52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵，UV-1800型紫外可見分光光度計，Agilent 6890N氣相色譜儀(氫火焰離子化檢測器)，Thermo scientific ISQ單四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

選取外形完好的大蒜，去皮洗凈放入組織搗碎機搗碎，搗碎的大蒜放入研缽中研磨成蒜泥。將蒜泥在25℃下靜置20 min進行酶解反應(yīng)。

1.2.2 大蒜硫代亞磺酸酯提取實驗

酶解反應(yīng)后的蒜泥加入溶劑浸提，將浸提液過濾，濾液即為大蒜提取物。分別考察乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比對提取物中硫代亞磺酸酯含量的影響。在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取各因素合適的水平，采用design expert8.0對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。

1.2.3 硫代亞磺酸酯穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物初步分析

1.2.3.1 硫代亞磺酸酯穩(wěn)定性實驗

將大蒜提取液在40℃，真空度0.09 MPa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，分別置于15℃、35℃、55℃、75℃和85℃下貯存，每隔2 h后測定硫代亞磺酸酯的含量。

1.2.3.2 硫代亞磺酸酯貯存過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

將1.2.3.1所述提取液置于25℃下，每隔5 h后取5 mL提取液加入3 mL正己烷進行振蕩萃取2 min，靜置分層，取上層有機相，采用氣相色譜-質(zhì)譜進行分析，并測定其中DAS、DADS和DATS的含量。

1.3 分析測定方法

1.3.1 硫代亞磺酸酯的測定

采用分光光度法［4］測定乙醇提取物中硫代亞磺酸酯含量。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)檢測條件

1.3.2.1 GC分析條件

色譜柱:HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);進樣口溫度:160℃;檢測器溫度:160℃;程序升溫:起始溫度 50℃，以 30℃/min的速率升溫至160℃，保持 2 min，然后以 80℃/min速率升溫至200℃，保持 1 min;氮氣:30 mL/min;氫氣:40 mL/min;空氣:300 mL/min;分流比 10∶1;進樣量:1 μl;保留時間定性，峰面積定量。

1.3.2.2 MS分析條件

接口溫度:250℃;電離方式為EI;離子源溫度:280℃;電子能量:70 eV;質(zhì)量掃描范圍:10～600amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對硫代亞磺酸酯提取量的影響

選取不同濃度的乙醇作為提取溶劑，固定料液比為1∶5(g/mL)，提取溫度25℃，提取時間1 h，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對硫代亞磺酸酯提取量的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extract amount of thiosulfinates

由圖1可以看出硫代亞磺酸酯的提取量隨著乙醇濃度的升高先增加后降低，在乙醇體積分數(shù)為65%時最高。實驗結(jié)果說明增加乙醇濃度能增加硫代亞磺酸酯的提取量，但隨著乙醇濃度的進一步提高，提取量反而下降。

2.1.2 提取溫度對硫代亞磺酸酯提取量的影響

選取體積分數(shù)65%乙醇作為提取溶劑，固定料液比為1∶5(g∶mL)，提取時間1 h，分別于不同溫度下提取，結(jié)果見圖2。

由圖2能夠看出，在提取溫度為15～20℃時，隨著溫度的升高提取量也逐漸增加，當溫度高于20℃時，隨著溫度的升高提取量下降。溫度升高會加劇分子的運動，有利于硫代亞磺酸酯的浸提，但溫度進一步升高，由于硫代亞磺酸酯的不穩(wěn)定性，會發(fā)生多種化學反應(yīng)生成許多小分子含硫化合物，而造成其損失。

2.1.3 提取時間對硫代亞磺酸酯提取量的影響

選取體積分數(shù)65%乙醇作為提取溶劑，固定料

圖2 提取溫度對硫代亞磺酸酯提取量的影響Fig.2 The effect of ethanol extract temperature on garlic thiosulfinates extract amount

圖3 提取時間對硫代亞磺酸酯提取量的影響Fig.3 The effect of ethanol extract time on garlic thiosulfinates extract amount

由圖3能夠看出，在提取時間為1～1.5 h時，提取量隨著時間的延長而增加;但提取時間超過1.5 h時，提取量開始下降。說明提取時間過長就會導致硫代亞磺酸酯轉(zhuǎn)化成其他的副產(chǎn)物而降低含量。

2.1.4 料液比對硫代亞磺酸酯提取量的影響

選取體積分數(shù)65%乙醇作為提取溶劑，提取溫度20℃，提取時間1.5 h，考察不同料液比對提取的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對硫代亞磺酸酯提取量的影響Fig.4 The effect of material/solvent on garlic thiosulfinates extract amount

由圖4能夠看出，料液比對硫代亞磺酸酯提取量的影響較大，料液比從1 g∶2 mL到1 g∶4 mL時，硫代亞磺酸酯提取量增長迅速，料液比從1 g∶4 mL到1 g∶6 mL時，硫代亞磺酸酯提取量增長變得相對緩慢。這說明隨著料液比的加大，硫代亞磺酸酯的提取量增加終將趨于一個極限，綜合考慮各種情況，料液比選擇 1 g∶4 mL 為宜。

2.2 Box-Behnken中心設(shè)計及其響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 模型建立

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心設(shè)計原理，以提取溫度、提取時間、乙醇濃度和料液比為自變量，硫代亞磺酸酯提取量為響應(yīng)值，Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表1?；貧w統(tǒng)計分析表見表2。

由方差分析的F值可知，料液比對提取量的影響較大，而乙醇濃度對提取量的影響較小，各因素對結(jié)果影響為料液比＞提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度。

響應(yīng)值與各因素進行回歸擬合后，得到硫代亞磺酸酯提取量的回歸方程如下:

提取量=4.10-0.039A-0.035B+0.29C-0.015D+6.25E-003AB-0.018AC+0.018AD+1.25E-003BC+0.024BD+0.034CD-0.12A2-0.501B2-0.31C2-0.081D2

從表2 可看出模型極顯著，其中，C，A2，B2，C2對實驗結(jié)果影響極顯著;該模型回歸決定系數(shù)R2為97.03%，失擬項不顯著(P＞0.05)，表明該回歸模型對實驗結(jié)果擬合良好，實驗誤差小，能夠較好的描述試驗結(jié)果，可以使用方程代替真實的實驗點進行分析。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Box-Behnken design and the results of the experiments

表2 回歸統(tǒng)計分析Table 2 Statistical results of regression analysis

通過軟件優(yōu)化確定理論最佳的提取條件為:提取溫度為 19.03℃，提取時間為 1.48 h，料液比為1∶4.47(g∶mL)，乙醇濃度為 64.81%。

2.3 硫代亞磺酸酯穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物初步分析

2.3.1 硫代亞磺酸酯穩(wěn)定性初步分析

不同溫度下硫代亞磺酸酯貯存穩(wěn)定性見圖5。由圖5可知，不同溫度下硫代亞磺酸酯的含量隨著時間的推移均呈現(xiàn)降低的趨勢，溫度越高，其下降的趨勢更加明顯?？梢?，溫度升高會導致硫代亞磺酸酯穩(wěn)定性下降，這是由于溫度升高會加速其中的各種化學反應(yīng)，熱還會引發(fā)的酸和親核加速的硫代亞磺酸酯的反應(yīng)∶S O質(zhì)子化后使硫代亞磺酸酯成為一陽離子硫代亞磺酸酯衍生物，受到親核攻擊產(chǎn)生相應(yīng)的二硫化物和硫代磺酸鹽［5］。

圖5 不同溫度下硫代亞磺酸酯貯存穩(wěn)定性Fig.5 Storage stability of thiosulfinates at different temperature

2.3.2 提取液貯存過程中硫代亞磺酸酯轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

根據(jù)氣相色譜分析結(jié)果，結(jié)合質(zhì)譜分析和資料報道［6］，確定提取液中主要的有機硫化物為 DADS、DATS、2-乙烯基-1，3-二硫雜-5-環(huán)己烯(2-VDT)和 3-乙烯基-1，2-二硫雜-5-環(huán)己烯(3-VDT)等，二烯丙基一硫醚(DAS)并沒有檢測出，還有許多有機硫化物沒有檢出或檢出量很少，這可能跟提取條件和檢測條件有關(guān)。從不同時間提取液的氣相色譜圖(圖6和圖7)可以看出，隨著貯存時間的延長，DADS和DATS的含量有明顯的增加，而3-VDT和2-VDT的含量有明顯的減少。根據(jù)Yu的報道［7］，大蒜提取液在貯存過程中，采用氣相色譜檢測，3-VDT和2-VDT的含量會減少直至檢測不到，而采用高效液相色譜法則檢測不到3-VDT和2-VDT。這是由于在氣相色譜的熱影響下，硫代亞磺酸酯會分解為烯丙基次磺酸和烯丙硫醛，后者進一步發(fā)生Diels-Alder反應(yīng)，聚合形成了3-VDT和2-VDT，這與本實驗的氣相色譜檢測結(jié)果相符，同時也進一步證實硫代亞磺酸酯的不穩(wěn)定性。

圖6 初始提取液氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of garlic extract at 0 h

圖7 36 h后提取液氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of garlic extract at 36 h

考慮到DADS和DATS的重要的生物活性功能［8］，進一步研究了提取液貯存過程硫代亞磺酸酯與DADS、DATS含量變化關(guān)系。由圖8可知，隨著時間的推移，提取液中硫代亞磺酸酯的含量一直呈現(xiàn)下降的趨勢，而DADS和DATS的含量呈現(xiàn)上升的趨勢，其中DATS含量增加非常明顯。硫代亞磺酸酯在室溫下會轉(zhuǎn)換成各種含硫化合物，其中硫代亞磺酸酯可以進一步轉(zhuǎn)變?yōu)槎┍蛎押蚐O2，通過水解反應(yīng)產(chǎn)生烯丙基亞磺酸和烯丙基硫醇，而烯丙基硫醇也可以和一分子蒜素生成二烯丙基三硫醚。硫代亞磺酸酯在加熱處理時會分解產(chǎn)生各種化合物，而且在不同條件下產(chǎn)物也不盡相同，如在中性或微酸性環(huán)境下，會形成更多的二烯丙基三硫醚和甲基烯丙基三硫醚，在堿性環(huán)境下，二烯丙基單硫醚、二烯丙基二硫醚、丙基烯丙基二硫、丙烯基硫醇含量會相對增多［9］。硫代亞磺酸酯的不穩(wěn)定性和產(chǎn)物分解轉(zhuǎn)化機理還有待進一步研究。

圖8 提取液存放時間對硫代亞磺酸酯、DADS和DATS含量的影響Fig.8 The effect of storage time on garlic extract thiosulfinates，DADS and DATS contents

3 結(jié)論

采用乙醇提取大蒜中硫代亞磺酸酯，研究了乙醇濃度、提取溫度、提取時間、超聲時間、料液比對硫代亞磺酸酯提取量的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝，結(jié)果表明:料液比是影響硫代亞磺酸酯提取量的顯著因素，實驗最后確定提取的最佳理論條件為:提取溫度為19.06℃，提取時間為1.48h，料液比為1∶4.48(g∶mL)，乙醇濃度為 64.89%，硫代亞磺酸酯含量可達4.17 mmol/100 g。對醇提的硫代亞磺酸酯穩(wěn)定性及其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化研究表明，硫代亞磺酸酯隨著溫度升高，穩(wěn)定性下降，DADS和DATS的含量隨著存放時間的延長而增加，與硫代亞磺酸酯為此消彼長的關(guān)系，本研究對大蒜實際生產(chǎn)及深加工應(yīng)用具有重要的意義。

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