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(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266021； 2 青島市海慈醫(yī)療集團; 3 山東中醫(yī)藥大學(xué))

肺纖維化是以肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷以及細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積為病理特點的一類疾病。大量研究證實，一些細(xì)胞因子參與了肺纖維化形成，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是促進纖維細(xì)胞激活向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[1]，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在肺纖維化發(fā)病中起重要作用，可作為肺泡炎癥活動性標(biāo)志[2]。西醫(yī)對肺纖維化治療習(xí)慣上采用糖皮質(zhì)激素聯(lián)合細(xì)胞毒藥物等治療，但長期應(yīng)用毒副作用顯著。近年來中醫(yī)藥治療肺纖維化的研究越來越多，并且取得了一定成績。淡滲利濕法治療肺系疾病有較好的療效，并且未見明顯副作用[3-4]。具有淡滲利濕之功的中藥以茯苓、薏苡仁、冬瓜子最為常見。本文通過動物實驗研究茯苓、薏苡仁、冬瓜子對博萊霉素致肺纖維化大鼠模型血清中TGF-β1和TNF-α濃度的影響，探討中醫(yī)淡滲利濕法治療肺纖維化的可行性及其機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物與分組 清潔級健康雄性Wistar大鼠72只(由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)監(jiān)中心實驗動物室提供)，體質(zhì)量180～220 g,月齡2～3月，在室溫18～22 ℃、空氣相對濕度為28%的環(huán)境中，每籠6只，利用自然光線并輔以人工光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、醋酸潑尼松組、茯苓組、薏苡仁組、冬瓜子組，每組12只。

1.1.2藥物 注射用鹽酸博萊霉素(每支15 mg,日本化藥株式會社生產(chǎn))，使用前以生理鹽水配制成所需濃度溶液；醋酸潑尼松(每片5 mg,上海信誼藥廠生產(chǎn))，磨碎溶于生理鹽水中，制成0.4 g/L滅菌水溶液。茯苓、薏苡仁、冬瓜子(青島市海慈醫(yī)療集團提供)，制成滅菌濃煎液，其藥物含量分別為1.47、2.20、2.20 kg/L。

1.1.3試劑及儀器 TGF-β1、TNF-α檢測ELISA試劑盒，由欣博盛生物科技有限公司提供；低溫冰箱；Nikon YS100光學(xué)顯微鏡及JEM-1230透射電子顯微鏡， 日本Olympus公司產(chǎn)品；RM 2126石蠟切片機，德國LEICA公司產(chǎn)品。

1.2 動物模型制備

按照文獻[5-6]方法，大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛(2 mL/kg)麻醉后，模型對照組及各治療組大鼠氣管內(nèi)均注入博來霉素溶液(16.7 g·L-1·kg-1)，并輕揉胸部片刻，使其均勻地分布于肺組織內(nèi)，以制備大鼠肺纖維化模型;正常對照組大鼠注入等體積生理鹽水。造模后,模型對照組大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、進食減少、脫毛、活動減少等癥狀和體征，光鏡下顯示肺泡組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺纖維化明顯加重，說明大鼠模型制備成功。

1.3 給藥方法和途徑

造模第2天，各組均開始連續(xù)給藥，用藥量據(jù)文獻[7]方法計算。醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松6 mg/(kg·d)，茯苓組、薏苡仁組、冬瓜子組藥物量分別為22、33、33 g/(kg·d)，模型對照組及正常對照組給予等體積的生理鹽水，各組均灌胃給藥，每天1次，至實驗結(jié)束。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

給藥后14、28 d，各組分別隨機取6只大鼠，腹腔注射水合氯醛進行麻醉，將四肢及背部固定，打開腹腔，分離腹主動脈，取血5 mL，低溫下離心，取血清，-20 ℃冰箱保存待測；打開并暴露胸腔，摘取右下肺，用中性甲醛固定24 h后石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色。參照文獻[8]方法，觀察所選取肺組織的病理變化情況；用雙抗體夾心ELISA法分別檢測大鼠血清中TGF-β1、TNF-α的含量，操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書的步驟進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠存活率

實驗過程中，模型對照組第26天死亡1只大鼠；余組未出現(xiàn)大鼠死亡。各組存活率比較，差異無顯著性(P>0.05)。

2.2 各組大鼠肺組織病理改變

肉眼觀察，正常對照組大鼠雙肺呈粉紅色，表面光滑，富有彈性；模型對照組大鼠雙肺顏色暗紅，邊緣可見點狀出血，部分肺葉體積縮小，并可見大小不一灰白色結(jié)節(jié)，彈性差；其他組處于以上兩組之間。光鏡下正常對照組無明顯病理變化，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁及肺泡間隔未見增厚，肺泡大小均勻，肺泡腔內(nèi)未見滲出；模型對照組給藥14 d可見肺組織肺泡炎癥明顯，肺泡間隔增厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞，成纖維細(xì)胞增殖，膠原基質(zhì)沉積，至28 d，炎癥細(xì)胞浸潤較14 d明顯減輕，肺泡組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肺纖維化明顯加重。各治療組的肺泡炎癥及纖維化程度較模型對照組均減輕：醋酸潑尼松組見肺臟炎癥細(xì)胞浸潤較輕，未見成纖維細(xì)胞增殖及膠原基質(zhì)增多；3個中藥組鏡下可見肺臟炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞不明顯，成纖維細(xì)胞及膠原基質(zhì)增多不明顯。

2.3 各組大鼠血清TGF-β1和TNF-α含量比較

給藥14和28 d，模型對照組大鼠血清中TGF-β1及TNF-α的含量均明顯高于正常對照組(F=181.586～488.612,q=28.253～89.142,P<0.05)，模型對照組血清中TGF-β1及TNF-α含量均明顯高于各治療組(q=8.613～75.682,P<0.05)；醋酸潑尼松組大鼠血清中TGF-β1、TNF-α含量均低于3個中藥治療組(q=3.538～12.563,P<0.05)。治療14 d,3個中藥治療組間TGF-β1及TNF-α含量差異無顯著性(P>0.05);治療28 d,茯苓組大鼠血清中TGF-β1、TNF-α含量均低于薏苡仁組、冬瓜子組(q=3.953～4.845,P<0.05)；薏苡仁組與冬瓜子組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1、2。

表1 給藥14 d各組大鼠血清TGF-β1和TNF-α含量比較

表2 給藥28 d各組大鼠血清中TGF-β1和TNF-α含量比較

3 討 論

肺纖維化在古代文獻沒有相應(yīng)病名，歸于中醫(yī)“咳嗽”、“肺脹”、“喘證”、“氣短”、“肺痿”、“肺痹”等范疇[9]。本病以肺、腎、脾氣陰虧虛為本虛，痰濁、熱毒、外邪、瘀血為標(biāo)實。羅毅[10]認(rèn)為痰、瘀既是肺纖維化主要的病理產(chǎn)物，也是病情加重的主要因素?！痘钛鰧］嫛吩? “血與水，上下內(nèi)外，皆相濟行，故病血者，未嘗不病水; 病水者，亦未嘗不病血也”，故水行則血自行；王步青等[11]認(rèn)為津液為患貫穿肺纖維化疾病的全過程，外邪客肺或肺氣虧虛，導(dǎo)致肺氣失常而津液不歸正化，釀成痰濕，阻于肺絡(luò)?？梢?，水液的正常輸布與本病的產(chǎn)生與進展有著密切的關(guān)系。三焦是全身氣、水、津、液運行的通道，對人體氣化功能、水液代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。肺居上焦，肺主氣、主行水等生理功能均與三焦密切相關(guān)。三焦對于水液運行有疏通、通導(dǎo)作用，肺對水液的升降出入具有調(diào)節(jié)作用。可見，氣之升降出入與水液代謝的調(diào)節(jié)關(guān)系密切。臨床研究顯示，肺氣不宣，氣機不暢、痰飲互結(jié)與三焦密切相關(guān)，淡滲利濕之法利濕、化痰、行水，清痰之源，可祛除因水液代謝功能障礙而產(chǎn)生的初始病理產(chǎn)物——“濕”、“水”、“飲”[3-4]，水液運行得以疏通，氣機調(diào)暢，可使三焦通利，恢復(fù)氣水津液的運行通道，上焦得通，痰濕隨水而化，淤邪從下焦?jié)B利而去。故在此思路指導(dǎo)下，無論何種證型的肺纖維化，均注意輔以淡滲利濕法治療，可取得良效。茯苓、薏苡仁、冬瓜子均具有利水消腫、滲濕等作用，《世補齋醫(yī)書》：“茯苓一味，為治痰主藥，痰之本，水也，茯苓可以行水。痰之動，濕也，茯苓又可行濕。”《本草綱目》：“薏苡仁，陽明藥也，能健脾益胃。虛則補其母，故肺痿、肺癰用之。” 崔禹錫在《食經(jīng)》評價冬瓜子：“利水道，去淡水?！?/p>

本實驗通過氣管內(nèi)注入博萊霉素水溶液制備動物模型，病理組織觀察顯示肺泡炎至肺纖維化的病變過程，血清中TGF-β1與TNF-α濃度明顯高于正常對照組，與文獻報道一致[12]，說明本實驗建立的大鼠肺纖維化模型是成功的。

已有研究顯示，TGF-β1在促進纖維細(xì)胞激活向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中起著關(guān)鍵作用[1]，作為有效的促纖維化因子，TGF-β1過度表達會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積[13]。成纖維細(xì)胞在TGF-β1趨化促進下分裂增殖以及成熟分化，并大量合成膠原蛋白，膠原不斷在肺間質(zhì)增積，而膠原蛋白酶及纖溶酶原激活物的合成被抑制，促進蛋白酶抑制物產(chǎn)生，使細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，另外細(xì)胞外基質(zhì)自身的穩(wěn)定也受到抑制[2]。TNF-α是一種小分子蛋白，主要在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞激活后釋放，具有極強的免疫調(diào)節(jié)特性以及促炎性作用[14]。它會影響多種正常細(xì)胞的生長以及分化[2]；在體內(nèi)外均能刺激白細(xì)胞介素-1(IL-1)的生成, IL-1是成纖維細(xì)胞潛在的有絲分裂原[15]；它還能刺激肺成纖維細(xì)胞增殖，促進膠原沉積[16]；另外，還可通過其細(xì)胞毒性作用，使肺泡上皮細(xì)胞不斷壞死、脫屑、再生，導(dǎo)致肺纖維化[2]。TGF-β1與TNF-α在肺纖維化發(fā)生過程中具有重要意義。

本文的研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠血清中TGF-β1與TNF-α明顯高于正常對照組，提示肺纖維化不僅存在肺組織的炎癥反應(yīng)，還會引起全身炎癥反應(yīng)；茯苓、薏苡仁、冬瓜子組大鼠肺組織病理顯示肺纖維化不明顯，且血清TGF-β1與TNF-α濃度均低于模型對照組，提示上述3種藥物能有效緩解博萊霉素誘發(fā)的肺纖維化進程，其作用機制與下調(diào)TGF-β1及TNF-α的水平有關(guān)；茯苓組血清TGF-β1與TNF-α水平低于薏苡仁、冬瓜子組，考慮其在緩解肺纖維化大鼠癥狀、減輕肺纖維化的療效上優(yōu)于薏苡仁、冬瓜子。

綜上所述，茯苓、薏苡仁、冬瓜子對博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化具有治療作用，為中醫(yī)藥治療肺纖維化提供一個新的思路，但其改善肺纖維化的作用機制尚需進一步研究。

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