(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021； 2 青島市黃島區(qū)中醫(yī)醫(yī)院)

角果木為紅樹科角果木屬植物，富含鞣質(zhì)、五環(huán)三萜和二萜。近年來角果木的藥用價值得到國內(nèi)外很多學(xué)者的重視，有學(xué)者用石油醚從角果木中部分分離提取出兩種Dolabrane型二萜，其中Tagalsins A為首次發(fā)現(xiàn)的新化合物[1]。相關(guān)研究證實，角果木提取物——Tagalsin系列化合物具有細胞膜通透性和殺傷腫瘤細胞的活性，可以抑制多種人類惡性腫瘤細胞的增殖，具備新藥開發(fā)價值[2]。本研究旨在觀察Tagalsin對裸鼠皮下卵巢癌移植瘤組織中bcl-2、p53基因表達水平的影響，探討Tagalsin對卵巢癌的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞株SKOV3購自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院; 4～6周齡雌性BALB/C裸鼠60只，體質(zhì)量15～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(SLAC); Tagalsin購自北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室；兔抗鼠bcl-2、p53一抗和SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和動物模型的建立

SKOV3細胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素各1 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，2.5 g/L胰酶消化后傳代。收集對數(shù)生長期的細胞，制備成密度為3×1010/L單細胞懸液，于超凈工作臺內(nèi)在裸鼠腋窩區(qū)皮下注射0.2 mL的單細胞懸液，注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，7 d后裸鼠均出現(xiàn)直徑大于0.5 cm的皮下結(jié)節(jié)，病理切片證實為惡性腫瘤，此時移植瘤模型建立。

1.3 裸鼠分組及給藥

將造模成功48只小鼠隨機分為空白對照組、順鉑作用組、Tagalsin作用組和Tagalsin+順鉑組，每組為12只。Tagalsin每天灌胃給藥1次(20 mg/kg)，順鉑每周腹腔注射給藥1次(5 mg/kg)，連續(xù)3周?？瞻讓φ战M用食用油代替藥物。

1.4 移植瘤體積及抑瘤率的測定

觀察裸鼠一般狀態(tài)，每天測量裸鼠體質(zhì)量。每3 d測量瘤體最長徑(a)和最短徑(b)，計算移植瘤的體積，移植瘤體積(mm3)=(1/2)ab2，求其平均值。根據(jù)移植瘤體積繪制腫瘤生長曲線并計算抑瘤率[3]，抑瘤率=(對照組平均體積-實驗組平均體積)/對照組平均體積×100%。停藥后24 h處死裸鼠，完整剝離瘤體。

1.5 免疫組化檢測P53、Bcl-2蛋白的表達

按SABC試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗作為空白對照。Bcl-2定位于細胞質(zhì)，P53定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。光鏡下隨機觀察10個高倍視野，以細胞無著色或陽性細胞數(shù)<10%為(-)，陽性細胞數(shù)10%～25%為(+)，陽性細胞數(shù)26%～75%為()，陽性細胞數(shù)76%～85%為()，陽性細胞數(shù)>85%為()。

1.6 RT-PCR檢測p53、bcl-2基因表達

取新鮮裸鼠移植瘤組織，按試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成的cDNA保存于-20 ℃，以β-actin為內(nèi)參，行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，采用Quantity One圖像分析軟件進行分析。引物序列如下：p53-sense，5′-AGGACCCT-GTCACCGAGA-3′；p53-anti-sense，5′-GTGGAAGC-CATAGTTGCC-3′；bcl-2-sense，5′-GGTGGTGGAG-GAACTCTTCAGGG-3′；bcl-2-anti-sense，5′-GAGA-CAGCCAGGAGAAATCAAACAGA-3′；β-actin-sense:5′TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′；β-actin-anti-sense:5′-GATGTCACGCACGATTTCC-3′。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0及PPMS 1.5[4]軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。多組均數(shù)的比較采用方差分析，非正態(tài)分布的樣本比較采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組裸鼠移植瘤體積和抑瘤率比較

各藥物作用組移植瘤體積明顯小于空白對照組，其中Tagalsin+順鉑組移植瘤體積最小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=59.31,q=2.47～9.66,P<0.05)；順鉑作用組與Tagalsin作用組差異無顯著意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組Bcl-2、P53蛋白表達比較

空白對照組、順鉑作用組、Tagalsin作用組及Tagalsin+順鉑組Bcl-2蛋白表達水平呈遞減趨勢，而P53蛋白表達水平則呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(u=3.425～9.652，P<0.05)；順鉑作用組與Tagalsin作用組之間差異無顯著意義(P>0.05)。見表2。

表1 不同藥物對裸鼠移植瘤生長影響±s)

表2 各組Bcl-2及P53蛋白表達比較(只)

2.3 各組bcl-2、p53 mRNA的表達

各藥物作用組bcl-2基因表達均明顯低于空白對照組，而p53基因表達則均明顯高于空白對照組，其中以Tagalsin+順鉑組變化最明顯；順鉑作用組及Tagalsin作用組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

3 討 論

卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，由于缺乏典型的臨床表現(xiàn)，目前很難做到早期診斷及早期治療。且放化療毒性作用使許多病人不能耐受。因此，尋找副作用輕且療效好的藥物已經(jīng)成為研究熱點。

利用紅樹植物治病，在中國民間已經(jīng)有幾百年的歷史，但是直到近年紅樹植物才被作為海洋藥物開發(fā)和新藥研究的主要源泉之一，人們對紅樹植物的化學(xué)成分和生物活性進行了系統(tǒng)及深入的研究。很多研究表明，紅樹植物含萜類、多糖、甾體和生物堿等化合物，具有抑菌、抗氧化、抗艾滋病以及抗腫瘤等作用[5-6]。AGSHIKAR等[7]報道，紅樹植物具有麻醉和抗炎的作用。目前，關(guān)于紅樹植物生物活性及抗腫瘤作用的研究僅僅局限于體外細胞水平，關(guān)于其體內(nèi)抗腫瘤作用及具體作用機制的研究鮮有報道。國內(nèi)有學(xué)者通過動物實驗證實，紅樹植物角果木Dolabrane型二萜對小鼠皮下肺癌移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，其抑制腫瘤的作用機制可能與腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的表達水平有關(guān)[8]。馮齡鑫等[9]研究顯示，中國紅樹植物角果木中Dolabrane型二萜成分Tagalsins A，具有抑制小鼠皮下肝癌移植瘤生長及延長肝癌小鼠生存期的作用，其作用機制可能與誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān)。

A：bcl-2 mRNA的表達，B：p53 mRNA的表達。①～④分別為空白對照組、順鉑作用組、Tagalsin作用組和Tagalsin+順鉑組。

bcl-2基因是從小鼠B淋巴瘤中分離得到的原癌基因。該基因能夠抑制細胞凋亡，促進細胞異常增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[10]。bcl-2基因發(fā)生突變而過度表達，則抑制了卵巢癌細胞凋亡，從而引起卵巢癌的發(fā)生。此外，細胞凋亡指數(shù)比較低的上皮性卵巢癌細胞，其bcl-2表達陽性率較高[11]。

p53基因是腫瘤抑制基因，分為野生型和突變型兩種，野生型p53半衰期比較短，免疫組化技術(shù)檢測不到，可通過引起DNA受損、細胞發(fā)生凋亡而阻止腫瘤的發(fā)生。突變的P53 蛋白在細胞內(nèi)含量高，因構(gòu)象發(fā)生改變，半衰期延長，并于核內(nèi)積聚，免疫組化技術(shù)可以檢測到。突變的p53基因產(chǎn)生的蛋白在腫瘤細胞中積累，可能是導(dǎo)致卵巢癌病人預(yù)后差的作用機制[12]。有研究顯示，P53蛋白不僅可以反映卵巢癌的分化程度，而且隨臨床分期進展P53蛋白表達陽性率增高[13]。

本研究結(jié)果顯示，各藥物作用組移植瘤體積明顯小于空白對照組，同時bcl-2基因表達明顯低于空白對照組，而p53基因表達明顯高于空白對照組，說明Tagalsin能有效抑制卵巢癌細胞的增殖，其抑瘤機制可能為通過上調(diào)卵巢癌細胞p53基因表達、下調(diào)bcl-2基因表達，從而調(diào)整了卵巢癌細胞周期，促進腫瘤細胞的凋亡。本文結(jié)果還顯示，單獨使用Tagalsin抑瘤作用與順鉑效果沒有明顯差別，但二者聯(lián)合應(yīng)用較單獨使用抑制卵巢癌增殖的作用明顯增強。本文結(jié)果為臨床治療卵巢癌藥物的應(yīng)用及新藥研發(fā)提供了理論依據(jù)。

綜上所述， Tagalsin有可能通過調(diào)控癌基因及抑癌基因的表達，調(diào)整細胞周期，從而有效地抑制卵巢癌細胞的增殖。但是Tagalsin的抑瘤作用是多因素的過程，目前對其他機制尚不十分明確，并且對于Tagalsin劑量的研究也較少，相信隨著對海洋藥物的不斷深入研究和探索，上述問題會逐漸明確，為治療卵巢癌的藥物選擇提供更多的理論基礎(chǔ)。

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