李玉芳洪志勇李 明張興峰林秀嬌李鴻翔莊益芬張文昌*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350002；2.黃淮學(xué)院 河南駐馬店 463000）

原始生殖細(xì)胞（PGCs）是具有高度未分化的發(fā)育全能性細(xì)胞。自Waldeyer(1870)首先在雞胚的生殖腺中發(fā)現(xiàn)PGCs以來(lái)，人們對(duì)雞PGCs的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增進(jìn)行了大量的研究。Chang等(1995)［1］將從2日齡雞胚血液中分離出的PGCs放在從5日齡雞胚中獲取的生殖原基細(xì)胞上培養(yǎng)5 d，發(fā)現(xiàn)PGCs增殖了近5倍，后來(lái)成功得到了嵌合體雞。Park［2］從5.5 d的雞胚生殖腺中分離PGCs并將其在體外培養(yǎng)4個(gè)月，然后分別用傳至3代和4代的PGCs制作嵌合體雞獲得了成功。Han等［3］將分離到的28期雞胚胎生殖腺的PGCs在不傳代的情況下離體培養(yǎng)了2個(gè)月。Petitte等［4］將不同類(lèi)型的飼養(yǎng)層和培養(yǎng)液對(duì)雞胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)效果進(jìn)行了比較。在國(guó)內(nèi)，李碧春、安靜、謝蓓、秦潔等［5-8］分別成功對(duì)X期胚盤(pán)細(xì)胞及PGCs細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)與傳代。本試驗(yàn)采用孵化6 d的雞胚胎制作成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)鵪鶉原始生殖細(xì)胞，并比較添加生長(zhǎng)因子與不添加生長(zhǎng)因子的效果，以及PGCs在培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)器材 CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化集團(tuán)制造)、孵化箱(北京海江孵化設(shè)備制造有限公司)、體視顯微鏡(Nikon SMZ-10)、玻璃毛細(xì)管、拉針儀、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、0.22 um微孔濾膜，六孔培養(yǎng)板、小牛血清（FBS）（Gibico）、BCIP/NBT 染色試劑盒（Amresco）、細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀（EG）。

1.2 試驗(yàn)試劑 0.25%胰蛋白酶（Gibio）溶液、EDTA溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA；無(wú) Ca2+、Mg2+的 PBS 溶液；Hank’s液、DMEM-F12 培養(yǎng)基(清大有為)、ES 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液、0.1%明膠、絲裂霉素-C、bFGF、SCF、mLIF、福爾馬林-乙醇定影液。

1.3 鵪鶉PGCs的培養(yǎng) (1)挑選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，置于無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)LIF生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果；(2)挑選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在有雞成纖維飼養(yǎng)層的情況下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果；(3)挑選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在添加LIF、SCF、bFGF(每孔分別添加10 uL配好的LIF、SCF、bFGF溶液)的雞成纖維飼養(yǎng)層上觀察培養(yǎng)情況。

1.4 鵪鶉PGCs的傳代 （1）觀察鵪鶉原始生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，選擇細(xì)胞克隆生長(zhǎng)良好，隆起明顯，形態(tài)未表現(xiàn)分化或剛剛表現(xiàn)分化跡象的細(xì)胞克隆進(jìn)行初次傳代；（2）用口吸管和鎢絲針把選擇好的克隆挑出，剝離周?chē)娘曫B(yǎng)層細(xì)胞，置于PBS中洗1次；（3）移入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA液中，37℃消化2～3 min；（4）用口吸管將細(xì)胞克隆從消化液中吸出，置于DMEM中洗2次；（5）移入細(xì)胞培養(yǎng)液中，用口吸管輕輕吹打并借助鎢絲針的作用將細(xì)胞團(tuán)分散為細(xì)胞懸液，置于新制備的飼養(yǎng)層中培養(yǎng)。

1.5 鵪鶉PGCs的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 借助倒置顯微鏡及解剖顯微鏡，觀察細(xì)胞集落的生長(zhǎng)情況、外部特征。

1.5.2 堿性磷酸酶（AKP）染色反應(yīng) (1)取無(wú)菌蓋玻片放置在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入0.1%明膠2 mL，使蓋玻片表面也均勻地涂有明膠；(2)取生長(zhǎng)情況良好的原始生殖細(xì)胞克隆放在包被有明膠的蓋玻片上，置于 37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h；(3)取已有原始生殖細(xì)胞的蓋玻片用福爾馬林-乙醇定影液固定15 min；(4)去掉固定液，用蒸餾水沖洗2次，加入 BCIP/NBT 染色液，37 ℃下染色 1.5～2 h；(5)用蒸餾水輕輕沖洗掉染色液，晾干后在倒置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

從表1可看出，在添加生長(zhǎng)因子的雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)原始生殖細(xì)胞，存活率明顯比其他2種高；在雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的鵪鶉PGCs存活率比在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的存活率高。

表1 鵪鶉PGCs在不同培養(yǎng)條件下數(shù)量及存活率變化情況

在不含飼養(yǎng)層和生長(zhǎng)因子條件下培養(yǎng)，基質(zhì)細(xì)胞成纖維狀貼壁生長(zhǎng)，原始生殖細(xì)胞的培養(yǎng)存活時(shí)間很短。培養(yǎng)2 d后以2～3個(gè)細(xì)胞的形式松散地聚在一起，并且很快出現(xiàn)分裂，形成的細(xì)胞團(tuán)與周?chē)嬖诿黠@界限，細(xì)胞彼此界限不清，細(xì)胞表面有折光較強(qiáng)的脂狀小滴（見(jiàn)圖1）。第3 d其成活率為42.8%，培養(yǎng)4～5 d細(xì)胞大部分形成細(xì)胞團(tuán)(見(jiàn)圖2)，培養(yǎng)5～6 d，基質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始脫落死亡，原始生殖細(xì)胞也大部分死亡（見(jiàn)圖3）。

圖1 培養(yǎng)2 d分化中的鵪鶉PGCs（AKP染色）

圖2 形成4～5個(gè)細(xì)胞克隆的鵪鶉PGCs

圖3 原始生殖細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)層及生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液中培養(yǎng)4～5 d

而當(dāng)原始生殖細(xì)胞置放在雞胚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上時(shí)，細(xì)胞的分化得到了有效抑制，第2 d原始生殖細(xì)胞仍保持單個(gè)的未分化狀態(tài)(見(jiàn)圖4)，此時(shí)部分培養(yǎng)的原始生殖細(xì)胞體積變大，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡（見(jiàn)圖5）。培養(yǎng)4～5 d后分化的程度比無(wú)飼養(yǎng)層的PGCs情況好，PGCs存活率為50%左右（見(jiàn)圖6）。

圖4 PGCs在雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上的培養(yǎng)（2 d）

圖5 出現(xiàn)空泡的鵪鶉PGCs

圖6 在雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)4～5 d的鵪鶉PGCs

在添加生長(zhǎng)因子的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，前3 d細(xì)胞基本不出現(xiàn)分化，保持單個(gè)的未分化狀態(tài)（見(jiàn)圖7），第4～5 d部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)分裂（見(jiàn)圖8）細(xì)胞存活 76%左右；培養(yǎng)至第 6～7 d，出現(xiàn) 7～8 個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞克?。慌囵B(yǎng)至第10 d時(shí)，細(xì)胞克隆為13～15個(gè)細(xì)胞左右，可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞的聚集，形態(tài)多樣，但多數(shù)呈島狀或巢狀（見(jiàn)圖9）。此時(shí)細(xì)胞形態(tài)不明顯，細(xì)胞間的接合不緊密，成纖維細(xì)胞大量死亡。換液傳代后鵪鶉PGCs仍然具有分裂增殖的能力（見(jiàn)圖10），經(jīng)AKP染色后，仍著色較深，與剛分離的PGCs形態(tài)相似。試驗(yàn)中PGCs傳代5次，細(xì)胞仍具有原始生殖細(xì)胞的形態(tài)，并保持其未分化狀態(tài)。

圖7 保持未分化狀態(tài)的鵪鶉PGCs

圖8 在含有生長(zhǎng)因子的雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)4～5 d的鵪鶉PGCs

圖9 鵪鶉PGCs培養(yǎng)10 d出現(xiàn)的細(xì)胞克隆（AKP染色）

圖10 換液后正在分裂的PGCs（AKP染色）

3 討論

Swartz(1982)［9］發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育的 13～29 期，雞PGCs呈現(xiàn)堿性磷酸酶活性，里面含有大量的脂滴和糖原，在AKP反應(yīng)中呈陽(yáng)性，經(jīng)AKP染色后呈紫紅色。本試驗(yàn)在細(xì)胞的分離階段及培養(yǎng)階段對(duì)所獲得的細(xì)胞通過(guò)形態(tài)學(xué)及AKP染色進(jìn)行鑒定，這些細(xì)胞與雞PGCs堿性磷酸酶染色形態(tài)相似，證明形態(tài)學(xué)及AKP染色法在鵪鶉PGCs的鑒定中一樣有效。

原始生殖細(xì)胞分離后，以游離的方式存在于培養(yǎng)液中，如果有其他基質(zhì)細(xì)胞，則依附于其他細(xì)胞而暫時(shí)固定下來(lái)，但很容易分離。本試驗(yàn)原始生殖細(xì)胞傳代過(guò)程即是利用了原始生殖細(xì)胞的游離性而分離的。

PGCs培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)是維持PGCs的未分化狀態(tài)。胚胎及機(jī)體發(fā)育過(guò)程中分化和分裂增殖一般同時(shí)進(jìn)行，而PGCs的建系要求PGCs既能快速無(wú)限增殖又能呈未分化狀態(tài)，因而抑制分化和擴(kuò)增是一對(duì)矛盾。禽類(lèi)PGCs常用雞胚成纖維細(xì)胞制作飼養(yǎng)層。雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)能分泌LIF樣物質(zhì)，用于制作培養(yǎng)基。鄒清雁等［10］用雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層分離培養(yǎng)雞的X期培盤(pán)細(xì)胞獲得了成功，并將類(lèi)ES細(xì)胞傳至9代，AKP染色為陽(yáng)性。安靜等（2003）［6］對(duì)雞的X期胚盤(pán)細(xì)胞在雞成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上成功傳代，并對(duì)傳至4代的細(xì)胞克隆經(jīng)形態(tài)學(xué)、AKP染色等方法檢測(cè)后表明其具有ES細(xì)胞的諸多特性。本試驗(yàn)采用3種不同方法，在相同培養(yǎng)時(shí)期（4～5 d）對(duì)鵪鶉PGCs的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行比較；同時(shí)對(duì)鵪鶉PGCs培養(yǎng)及傳代過(guò)程中的存活率、分裂、細(xì)胞分化方面進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)雞胚成纖維細(xì)胞可在3種生長(zhǎng)因子的作用下對(duì)胚胎干細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持8～9 d，論證了生長(zhǎng)因子 LIF、bFGF、SCF 對(duì) PGCs的抑制分化和促進(jìn)分裂增殖的作用，與前人的試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)嘗試在第7 d對(duì)鵪鶉PGCs傳代，傳至5代，AKP染色后發(fā)現(xiàn)仍有PGCs存活，部分細(xì)胞具有分裂增殖的能力。鵪鶉PGCs的成功傳代對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作及瀕危鳥(niǎo)類(lèi)的物種保護(hù)具有重要的意義。

［1］ Chang I,Jeong D K,Hong Y H,et a1.Production of germline chimeric chicken by transfer of cultured chick primordial germ cells［J］.Cel Biol Int,1997,21:495-499.

［2］ Park T S,Han J Y.Derivation and characterization of pluripotent embryonic germ cells in chicken［J］.Mol Reprod and Deve,2000,56:475-482.

［3］ Han J Y,Park T S,Hong Y H,et a1.Production of germline chimeras by transfer of chicken gonadal primordial germ cells maintained in vitro foran extended period［J］.Theriogenology,2002,58:1521-1530.

［4］ Petitte J N,Liu G,Yang Z.Avian pluripotent stem cells［J］.Mech Dev,2004,121:1159-1168.

［5］ 李碧春,秦潔.雞胚不同發(fā)育時(shí)期原始生殖細(xì)胞的分離方法［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào),2003,49(6):835-842.

［6］ 安靜,杜立新.雞胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào),2003,49(5):698-703.

［7］ 謝蓓,黃海,胡小芬,等.雞胚胎原始生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志,2005,27:225-229.

［8］ 秦潔,李碧春,陳國(guó)宏,等.雞胚胎原始生殖細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào),2005,51(4):723-731.

［9］ Swartz W J.Acid and alkaline phosphatase activity in migrating primordial germ cells from the early embryo［J］.Anat Rec,1982,202:375-385.

［10］ 鄒清雁,張淑蓮,鄭曲波,等.雞胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立［J］.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2000,20:206-209.