劉 晶，李 華,2，陶永勝,2，張 莉,2，王 華,2,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

兩性花毛葡萄NW196是以東亞種野生毛葡萄為母本，歐亞種釀酒葡萄品種“粉紅玫瑰”為父本經(jīng)遠(yuǎn)緣雜交選育出的兩性花雜交種后代[1]。該品種葡萄具有著果率高、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗病性較強(qiáng)等特點(diǎn)，果實(shí)品質(zhì)及釀酒性能均優(yōu)于原野生毛葡萄而又能保持原特色[2]，且其能利用南方氣候條件優(yōu)勢(shì)正常生產(chǎn)出一年兩熟葡萄，二茬果一般在11月下旬成熟，有效調(diào)節(jié)了葡萄釀造加工原料供應(yīng)期，深受釀造加工企業(yè)的歡迎[3]。

葡萄酒香氣是構(gòu)成葡萄酒產(chǎn)品感官質(zhì)量的重要方面，能夠體現(xiàn)葡萄酒的感官特征和典型性[4]。目前，在葡萄酒中已經(jīng)鑒定出1000多種風(fēng)味化合物，這些化合物除了來源于葡萄果實(shí)以外，絕大部分來源于酵母菌的酒精發(fā)酵過程[5]，因此釀造工藝對(duì)葡萄酒中揮發(fā)性成分的組成及其含量具有重要影響。目前葡萄酒釀造中使用的方法有連續(xù)發(fā)酵法、旋轉(zhuǎn)罐發(fā)酵法、熱浸漬工藝和CO2浸漬發(fā)酵等，其中CO2浸漬釀造法是將整粒葡萄漿果置于充滿CO2的密閉容器中首先進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)發(fā)酵，然后在進(jìn)行酒精發(fā)酵，所釀制的葡萄酒色澤鮮艷，香氣濃郁，口味豐滿柔和，具有純凈優(yōu)雅爽悅的口感，且酸度低、成熟快，富有新鮮悅?cè)说墓阄杜c醇美協(xié)調(diào)的酒香味，具有獨(dú)特的風(fēng)格[6-7]。

目前我國葡萄酒生產(chǎn)中普遍采用歐亞種葡萄，有關(guān)該種葡萄及其所釀酒中揮發(fā)性成分的研究較多[8-10]，但對(duì)我國特有的野生毛葡萄及其雜交種所釀葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的研究較少。本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)儀對(duì)4種工藝釀造的兩性花毛葡萄NW196干紅葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，分析CO2浸漬工藝和蘋果酸乳酸法對(duì)其種類和含量的影響，旨在為充分開發(fā)利用野生毛葡萄及其雜交種葡萄種質(zhì)資源、釀造我國特色葡萄酒提供建議和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩性花毛葡萄NW196葡萄一茬果，2011年7月15日采收于廣西省河池市都安瑤族自治縣。原料含糖量為178.4g/L，含酸量(以酒石酸計(jì))為14.05g/L。

乙醇、二氯甲烷均為色譜純；無水硫酸鈉、硫酸鎂為分析純；2-辛醇(標(biāo)樣)。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Finnigan TRACE DSQ氣相色譜-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀 美國Finnigan公司；SENCO W20薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科有限公司；SHB-111真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；純水機(jī) 英國Millipore公司；超聲波萃取儀、磁力攪拌器等。

1.3 方法

1.3.1 釀酒工藝

葡萄采收后按照4種工藝釀造NW196干紅葡萄酒：(1)傳統(tǒng)工藝(196CK)：參照西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院“小容器釀造規(guī)范”，酒精發(fā)酵結(jié)束后加入SO2(50mg/L)終止發(fā)酵[7]；(2)CO2浸漬釀造工藝(196CK＋MLF)：葡萄→分選→整穗入罐(通入CO2，加入SO260mg/L)→厭氧浸漬(15d、30～35℃，每隔1d補(bǔ)充CO2)→分離壓榨→酒精發(fā)酵(18～20℃)→發(fā)酵中止，分離→倒罐→低溫貯藏[11]；(3)傳統(tǒng)工藝＋蘋果酸乳酸發(fā)酵(196MC)：按傳統(tǒng)工藝酒精發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)蘋果酸乳酸發(fā)酵，然后加入SO2(50mg/L)終止發(fā)酵，分離→倒罐→低溫貯藏；(4) CO2浸漬釀造工藝＋蘋果酸乳酸發(fā)酵(196MC＋MLF)：按CO2浸漬工藝酒精發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)蘋果酸乳酸發(fā)酵，然后加入SO2(50mg/L)終止發(fā)酵，分離→倒罐→低溫貯藏。

1.3.2 樣品制備

取50mL酒樣加入到100mL具塞錐形瓶中，添加20μL 2-辛醇乙醇溶液(500mg/L，內(nèi)標(biāo)物)，2g MgSO4粉末和20mL二氯甲烷，錐形瓶加蓋密封。置冰浴中，在磁力攪拌器上攪拌萃取(500r/min)1h，混合物經(jīng)超聲波超聲15min(25℃)，去除乳化現(xiàn)象，收集有機(jī)相，無水Na2SO4脫水，有機(jī)相濾紙過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1mL，供GC-MS上機(jī)分析。每個(gè)樣品的揮發(fā)性成分萃取操作做3次重復(fù)[12-13]。

1.3.3 色譜條件

色譜條件：色譜柱RtxR25 MS(15m×0.25mm，0.25μm)；樣口溫度為260℃，柱溫箱起始溫度60℃，保留時(shí)間2.5min，以6℃/min升溫至240℃，保留15min；載氣He，流速1mL/min；分流比80：1，進(jìn)樣量1μL。

質(zhì)譜條件：電子電離(electron inoization，EI)方式，電離電壓70eV，離子源溫度200℃，連接桿溫度260℃。

1.3.4 揮發(fā)性成分的定性定量分析

定性分析：樣品總離子流圖中色譜峰定性采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀隨機(jī)所帶NIST 2.0譜庫和Willey譜庫檢索，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)保留指數(shù)比對(duì)確認(rèn)[14]。

定量分析：采用2-辛醇內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量，計(jì)算公式如下[14]：

檢測(cè)物質(zhì)濃度=(檢測(cè)物質(zhì)峰面積/2-辛醇峰面積)×2-辛醇濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 干紅葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS檢測(cè)結(jié)果

圖 1 4種葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS總離子圖Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile compounds in wine made by four different processes

使用GC-MS對(duì)4種工藝釀造的NW196干紅葡萄酒的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，總離子圖見圖1，利用NIST02版本圖譜檢索進(jìn)行檢索，鑒定出的各揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量見表1。檢索結(jié)果表明，傳統(tǒng)工藝釀造的NW196干紅葡萄酒(196CK)經(jīng)GC-MS分析，分離出45個(gè)峰，鑒定出40種揮發(fā)性物質(zhì)，包括12種醇(258.52mg/L)、19種酯(51.28mg/L)、5種酸(9.49mg/L)、3種酮(2.08mg/L)和1種酚(0.29mg/L)。傳統(tǒng)工藝＋蘋果酸乳酸發(fā)酵的NW196干紅葡萄酒(196CK＋MLF)分離出50個(gè)峰，鑒定出42種揮發(fā)性物質(zhì)，包括12種醇(293.56mg/L)、17種酯(43.37mg/L)、6種酸(10.34mg/L)、3種酮(3.14mg/L)、2種酚(2.14mg/L)、1種酸酐(0.33mg/L)和1種含氮化合物(0.15mg/L)。CO2浸漬工藝釀造的NW196干紅葡萄酒(196MC)分離出47個(gè)峰，鑒定出42種揮發(fā)性物質(zhì)，包括14種醇(243.81mg/L)、18種酯(61.96mg/L)、6種酸(12.23mg/L)、1種酮(1.11mg/L)、2種酚(3.63mg/L)和1種含氮化合物(1.04mg/L)。CO2浸漬工藝＋蘋果酸乳酸發(fā)酵的NW196干紅葡萄酒(196MC＋MLF)分離出54個(gè)峰，鑒定出45種揮發(fā)性物質(zhì)，包括13種醇(294.17mg/L)、17種酯(51.90mg/L)、8種酸(19.59mg/L)、3種酮(2.67mg/L)、3種酚(7.78mg/L)和1種酸酐(0.31mg/L)。

2.2 醇類物質(zhì)的分析

葡萄酒中的醇類主要來源于酒精發(fā)酵、氨基酸轉(zhuǎn)化及亞麻酸降解物的氧化[15]。由表1可知，4種工藝釀造的葡萄酒中醇類物質(zhì)均占主要部分，共檢測(cè)到16種醇類，其中有8種是4種酒所共有的，它們是：丙醇、2-甲基-1-丙醇、丁醇、3-甲基-1-丁醇、L-(＋)-2,3-丁二醇、3-(甲硫基)-1-丙醇、苯甲醇和苯乙醇。從醇類物質(zhì)的總含量上來看，均是進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵的葡萄酒比未經(jīng)此發(fā)酵的葡萄酒中高，如196CK＋MLF酒樣比196CK酒樣中醇類含量高35.04mg/L，196MC＋MLF酒樣比196MC酒樣高50.36mg/L，這說明蘋果酸乳酸發(fā)酵可以增加酒樣中醇類物質(zhì)的含量，但并未豐富其種類，只有196MC酒樣中有14種醇類，其他酒樣中分別為12、12和13種。4種酒樣中，含量最高的兩種物質(zhì)均是異戊醇和苯乙醇，說明這兩種醇類物質(zhì)是NW196干紅葡萄酒中的主要物質(zhì)。此外，3-戊醇和2-甲基-6-庚烯-1-醇只在傳統(tǒng)工藝葡萄酒中發(fā)現(xiàn)，而3-乙氧基-1-丙醇、3-苯丙醇和6-甲基-5-庚烯-2-醇僅在CO2浸漬葡萄酒中檢測(cè)到，其中以3-苯丙醇在兩組酒樣中的含量差異最為明顯，在傳統(tǒng)工藝葡萄酒中沒有檢測(cè)到，而在CO2浸漬葡萄酒中分別高達(dá)1.74mg/L和2.26mg/L，這說明不同的釀造工藝對(duì)葡萄酒中醇類物質(zhì)的種類具有重要的影響。

表 1 4個(gè)酒樣中醇類化合物的含量Table 1 Contents of alcohol compounds in four samples

2.3 酯類化合物的比較及分析

表 2 4個(gè)酒樣中酯類化合物的含量Table 2 Contents of ester compounds in four samples

酯類物質(zhì)是葡萄酒中重要的芳香物質(zhì)之一，絕大多數(shù)酯類使葡萄酒形成愉快的香氣[16-17]。由表2可知，4種葡萄酒中共檢測(cè)到24種酯類化合物，其中有10種是4種酒共有的。酯類物質(zhì)總含量的變化規(guī)律表現(xiàn)為CO2浸漬發(fā)酵的葡萄酒比傳統(tǒng)工藝發(fā)酵的葡萄酒中酯類含量高，如196MC酒樣中酯類含量比196CK酒樣多10.68mg/L，196MC＋MLF酒樣比196CK＋MLF酒樣多8.53mg/L；但進(jìn)行了蘋果酸乳酸發(fā)酵的葡萄酒中酯類物質(zhì)的含量卻比未經(jīng)此發(fā)酵的葡萄酒中低，這表明CO2浸漬能夠使葡萄酒酯類香氣更加濃郁，同時(shí)也說明浸漬工藝對(duì)葡萄酒中酯類物質(zhì)含量的影響比是否進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵的影響更大。此外，196CK酒樣中含量較高的酯類有丁二酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸酯、1,3-丙二醇二乙酸酯和4-羥基丁酸乙酰酯；196CK＋MLF酒樣中含量較高的酯類為丁二酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯、4-羥基丁酸乙酰酯、1,3-丙二醇二乙酸酯和乙酸異戊酯；196MC酒樣中含量較高的酯類分別為：丁二酸乙酯、L-抗壞血酸-2,6-二棕櫚酸酯、亞油酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯和油酸乙酯，196MC＋MLF酒樣中含量較高的酯類為丁二酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯、4-羥基丁酸乙酰酯、亞油酸乙酯和油酸乙酯。癸酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯是CO2浸漬葡萄酒中特有的，而1,3-丙二醇二乙酸酯、1,4-丁二醇二乙酸酯和羥基丁二酸二乙酯僅在傳統(tǒng)工藝葡萄酒中發(fā)現(xiàn)。甲酸己酯和乙酰甘氨酸乙酯僅在196CK＋MLF酒樣中檢測(cè)到，與此相反，油酸乙酯、亞油酸乙酯和亞麻酸乙酯只存在于其他3種酒樣中，并且在196MC酒樣中的含量顯著多于其他酒樣，其含量分別為3.94、7.15mg/L和2.93mg/L。

2.4 酸類化合物的分析

表 3 4個(gè)酒樣中酸類化合物的含量Table 3 Contents of acid compounds in four samples

由表3可知，4種酒樣中酸類化合物的含量都比較高，這是由于NW196葡萄本身酸度就比一般釀酒葡萄高很多的原因。一般研究結(jié)果表明[18-21]，和傳統(tǒng)工藝對(duì)比，CO2浸漬工藝葡萄酒中總酸含量明顯降低，而本實(shí)驗(yàn)在CO2浸漬葡萄酒中檢測(cè)到的羧酸物質(zhì)總含量比傳統(tǒng)工藝葡萄酒中的高，推測(cè)總酸降低的原因?yàn)槠渌犷惔蠓冉档?，其原因有待于進(jìn)一步探索。另外，進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵的葡萄酒中羧酸物質(zhì)的總含量均比未經(jīng)此發(fā)酵的葡萄酒中高，如196CK＋MLF酒樣中酸類含量比196CK酒樣多0.85mg/L，196MC＋MLF酒樣中比196MC酒樣多7.36mg/L。4種酒中共檢測(cè)到11種酸類化合物，其中有4種是4種酒所共有的，它們是：己酸、辛酸、癸酸和2-甲基丙酸，但它們?cè)诿糠N酒樣中的含量有所不同。2-甲基丁酸、3-甲基丁酸和2-甲基己酸分別于不同離子圖中同一出峰時(shí)間檢測(cè)到，說明同一葡萄原料采用不同的釀造工藝可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)，這些低級(jí)脂肪酸都具有明顯的脂肪味，對(duì)NW196干紅葡萄酒的整體結(jié)構(gòu)具有重要作用。棕櫚酸、9-癸烯酸和甲羥丙二酸只在196MC＋MC酒樣中檢測(cè)到，其中棕櫚酸是弱極性化合物，呈顯著脂肪酸和蠟香，略有果香和乳香，對(duì)于干紅葡萄酒的味感平衡具有調(diào)節(jié)作用[22]。

2.5 其他化合物的分析

表 4 4個(gè)酒樣中其他類化合物的含量Table 4 Contents of other compounds in four samples

由表4可知，4種酒樣中共檢測(cè)到5種酮類化合物，其中只有2-辛桐為其共有。從酮類總量上來看，均是進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵的酒樣中比未經(jīng)此發(fā)酵的含量高。4-甲氧基-3-羥基苯乙酮和2,3-戊二酮只存在于傳統(tǒng)葡萄酒中，且進(jìn)行蘋乳發(fā)酵的酒中比未經(jīng)此發(fā)酵的分別高0.78mg/L和0.43mg/L；而4-甲氧基-2-羥基苯乙酮只在196MC＋MC酒樣中檢測(cè)到，且該物質(zhì)與傳統(tǒng)葡萄酒中的4-甲氧基-3-羥基苯乙酮僅在羥基的位置上發(fā)生變化，說明釀造工藝可影響香氣成分的結(jié)構(gòu)。在4種葡萄酒中還檢測(cè)到4種酚、1種酸酐和1種含氮化合物。在兩種傳統(tǒng)葡萄酒中檢測(cè)到3-乙基苯酚，而在CO2浸漬葡萄酒中則發(fā)現(xiàn)4-乙基苯酚，且后者含量顯著比前者高，再次表明釀造工藝對(duì)香氣成分的結(jié)構(gòu)和含量均有重要影響。苯酚僅在196MC＋MC酒樣中檢測(cè)到，而4-乙基-2-甲氧基苯酚出現(xiàn)在除了196CK酒樣外的其他3種酒樣中。戊烯二[酸]酐僅在經(jīng)過蘋果酸乳酸發(fā)酵的酒樣中(196CK＋MLF和196MC＋MLF)檢測(cè)到，且其在兩者中含量差別不大。此外，在196CK＋MLF和196MC 酒樣中均檢測(cè)到N-乙基乙酰胺。

3 結(jié)論與討論

本研究分析了CO2浸漬工藝和蘋果酸乳酸發(fā)酵對(duì)NW196干紅葡萄酒中揮發(fā)性成分的影響，各酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)總含量的大小順序?yàn)椋?96MC＋MLF＞196CK＋MLF＞196MC＞196CK。和傳統(tǒng)葡萄酒相比，CO2浸漬酒中酮類物質(zhì)的含量相對(duì)較低，但是酯類、酸類和酚類等物質(zhì)的含量以及揮發(fā)性物質(zhì)種類總數(shù)和總含量均表現(xiàn)出不同程度的上升，如196MC酒樣中酯類含量較196CK酒樣增加了20.80%，196MC＋MLF酒樣中酯類含量較196CK＋MLF酒樣增加了19.68%，這表明CO2浸漬處理能夠豐富葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)。對(duì)于蘋果酸乳酸發(fā)酵，雖然此發(fā)酵的進(jìn)行沒有增加葡萄酒中酯類物質(zhì)的種類和含量，但其顯著增加了酒中醇類、酸類、酮類、酚類等物質(zhì)的含量以及揮發(fā)性物質(zhì)種類總數(shù)和總含量，所以完成蘋果酸乳酸發(fā)酵的葡萄酒比酒精發(fā)酵終止酒揮發(fā)性成分更加復(fù)雜。在兩種CO2浸漬葡萄酒中檢測(cè)到了9-十六碳烯酸乙酯和具有水果香味的癸酸乙酯[23-24]，在進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵的CO2浸漬葡萄酒中檢測(cè)到了丙酮酸異戊酯、棕櫚酸、9-癸烯酸、苯酚和2-羥基-4-甲氧基苯乙酮等物質(zhì)，而且CO2浸漬葡萄酒和傳統(tǒng)工藝釀造的葡萄酒所共有的揮發(fā)性物質(zhì)含量也有很大不同，這些都說明CO2浸漬處理產(chǎn)生的葡萄酒中揮發(fā)性成分差異性是非常明顯的，不同的釀造工藝能夠使同一葡萄原料釀造出不同風(fēng)格的葡萄酒，這對(duì)于改善葡萄酒市場(chǎng)產(chǎn)品同一化嚴(yán)重的現(xiàn)象提高了很好的思路，將CO2浸漬特殊釀酒工藝結(jié)合蘋果酸乳酸發(fā)酵應(yīng)用到我國特有的兩性花毛葡萄酒的釀造中，能夠?yàn)槠咸丫剖袌?chǎng)提供更具特色的葡萄酒。當(dāng)然，葡萄酒的香氣質(zhì)量不僅取決于揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量，還與其感覺閾值和各成分之間相互作用密切相關(guān)，所以應(yīng)該結(jié)合感官品評(píng)等方面綜合考察CO2浸漬工藝對(duì)NW196干紅葡萄酒質(zhì)量的影響。

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