劉鐵成

(1.哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150012;2.哈藥集團(tuán)生物工程有限公司 黑龍江哈爾濱 150012;3.東北林業(yè)大學(xué) 黑龍江哈爾濱 150040)

抗EGFR單克隆抗體是一種糖基化、共價交聯(lián)的四聚體，由兩條重鏈、兩條輕鏈組成。全抗體分子量為145.38kD，等電點(diǎn)為7.8-8.3，消光系數(shù)1.40。這樣的大分子物質(zhì)，在生物分泌的過程中要經(jīng)過很復(fù)雜的空間折疊和糖基化修飾，這樣不同方法構(gòu)建的細(xì)胞在分泌的過程中難免會有電荷方面的差異，研究找到一種方法能夠體現(xiàn)出這種差異，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)離子交換色譜法可以滿足這樣的實(shí)驗(yàn)要求了。通常這種差異體現(xiàn)在抗體的異質(zhì)性方面。在其異質(zhì)性研究過程中發(fā)現(xiàn)，隨著破壞試驗(yàn)條件的改變，不同的抗體存在著各自的差別，這樣的發(fā)現(xiàn)對高級結(jié)構(gòu)修飾差異引起的抗EGFR單克隆抗體的鑒定都有重大意義。根據(jù)高效液相色譜法分析，各峰之間的異同，可以很好的鑒別產(chǎn)品的特點(diǎn)和優(yōu)勢。

1 材料與設(shè)備

色譜柱：CM-STAT，4.6*100mm，TSKgel；色譜系統(tǒng)：安捷倫1260，自動進(jìn)樣器，紫外檢測器，4原梯度泵；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉；氯化鈉；抗EGFR單克隆抗體供試品(哈藥集團(tuán)技術(shù)中心提供)；愛必妥(ImClone公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

表1 破壞性試驗(yàn)結(jié)果

樣品處理：將抗EGFR單克隆抗體供試品用5ml注射用水復(fù)溶后，用流動相A稀釋10倍，即1mg/ml。愛必妥用流動相A稀釋到1mg/ml。

流動相配制 流動相A：10mmol/L磷酸鹽緩沖液。稱二水磷酸二氫鈉1.37g，十二水磷酸氫二鈉0.44g，加水至0.9L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH到6.0,定容到1L。流動相B：10mmol/L磷酸鹽緩沖液，200mmol/L氯化鈉。稱二水磷酸二氫鈉1.37g，十二水磷酸氫二鈉0.44g，氯化鈉11.688g，加水至0.9L，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)pH到6.0,定容到1L。流動相用0.45μm水溶性膜過濾，超聲脫氣15分鐘即可。

色譜條件：流速0.5ml/min；柱溫25℃；檢測紫外檢測波長214nm；上樣量5ul；記錄時間：20min。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

比較分析愛必妥和抗EGFR單克隆抗體供試品在破壞條件下離子色譜變化差異(表1)

4 結(jié)果討論

從藍(lán)色峰圖可以看到，愛必妥和抗EGFR單克隆抗體供試品主峰區(qū)各峰比例存在一定的差異，且主峰區(qū)前面的酸性區(qū)(保留時間0～6min)峰數(shù)量有差異(愛必妥有一個峰，抗EGFR單克隆抗體供試品有兩個峰)。這是由于兩種制劑的糖含量以及糖型的種類存在差異，這樣就導(dǎo)致蛋白酸堿性的差異，從而使主峰區(qū)內(nèi)各峰的含量存在差異，最終產(chǎn)生峰型的差異。酸性區(qū)的峰存在差異，愛必妥和抗EGFR單克隆抗體供試品的酸性區(qū)均有峰1，2(保留時間0～2min)，且愛必妥較抗EGFR單克隆抗體供試品的峰1，2含量高；僅抗EGFR單克隆抗體供試品有峰3(保留時間2～4min)，從破壞性試驗(yàn)結(jié)果可知，經(jīng)氧化破壞后，愛必妥也會產(chǎn)生峰3，且抗EGFR單克隆抗體的峰3含量會增加。

通過以上分析和討論，說明不同抗EGFR抗體產(chǎn)品在離子交換色譜發(fā)檢測中，存在著差異，這樣就對不同廠家生產(chǎn)的抗EGFR抗體有著鑒別的作用。

[1]Vlasak,Ion escu R.Heterogeneity of Monoclonal Antibodies Rebealed by Charge-Sensitive Methods[J].Corr.Oharm.Biotechnol,2008,9(6):468-481.

[2]裴朝玉,楊麗霞.抗EGFR單克隆抗體藥物純度分析.周口師范學(xué)院學(xué)報,第30卷第2期2013年3月.