吳雨川 李桂紅

(1.黑龍江省食品藥品檢驗檢測所 黑龍江哈爾濱 150001;2.哈藥集團制藥六廠 黑龍江哈爾濱 150056)

B族維生素是維持人體正常機能與代謝活動不可或缺的水溶性維生素,包括維生素B1、核黃素、煙酸泛酸、維生素B6、生物素、葉酸、維生素B12等。由于其水溶性,B族維生素在體內(nèi)滯留的時間只有數(shù)小時,就會完全排出體外,所以,B族維生素必須每天補充。其中維生素B12又稱鈷胺素或氰鈷素,是一種由含鈷的卟啉類化合物組成的B族維生素,主要生理功能是參與制造骨髓紅細胞,防止惡性貧血;防止大腦神經(jīng)受到破壞。維生素B12是由細菌合成的,在動物組織中發(fā)現(xiàn)維生素B12在細胞分裂和生長中起關(guān)鍵作用,與葉酸關(guān)系密切[1]。

為了簡便快捷的測定B族維生素片中維生素B12的含量,經(jīng)查閱文獻資料,制訂了B族維生素片中維生素B12的檢測方法[2]。本文采用高效液相色譜法測定其含量。該方法靈敏度高,重復(fù)性好,操作簡便快捷,專屬性強,且其輔料、溶劑對含量測定無干擾,濃度-峰面積線性關(guān)系良好,方法測定結(jié)果變異小,可有效控制本品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀(Waters公司);超聲波清洗機(RUC-5500DTB)電子天平(梅特勒公司);乙腈(色譜純,美國TEDIA公司);磷酸(色譜純,FLUKA公司)。維生素B12對照品(中國藥品生物制品檢定所100248-200201)。B族維生素片(生產(chǎn)企業(yè)提供,批號:20120401,20120402,20120403);水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

表1 回收率試驗結(jié)果

表2 樣品含量測定結(jié)果

高效液相色譜柱GRACE Alltima amino氨基柱(5μm,4.6*250mm),以3%磷酸溶液—乙腈(25:75)為流動相;流速為1.0ml/min,檢測波長為361nm,柱溫為30℃,進樣量20μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備

避光操作。精密稱取維生素B12對照品11.22mg,置100ml棕色量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1ml,置50ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

避光操作。取供試品研細,精密稱取4g,置50ml棕色量瓶中,加約30ml水,在超聲波水浴中超聲提取10min,取出,用水稀釋至刻度,混勻,用0.45μm濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 專屬性試驗

取空白輔料按配方量稱取適量,按“2.2.2”項下方法配制陰性對照溶液。取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液,按“2.1”色譜條件測定,結(jié)果表明陰性按HPLC方法操作,記錄色譜圖,見圖1。結(jié)果表明,陰性對照液對測定無干擾。

2.4 線性范圍考察

對照品溶液

取“2.2.1”項下對照品儲備液,分別精密量取0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml、4.0ml、5.0ml,分別置50ml量瓶中,用水稀釋至刻度,分別進樣20 μl ,記錄色譜圖。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸,得回歸方程:A=1.46×105×C+177.74,相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果表明,維生素B12在0.5-10μg·ml-1濃度范圍內(nèi)線性良好。

陰性對照溶液

供試品溶液

2.5 檢測限

取對照品溶液,定量稀釋成系列濃度溶液,照上述色譜條件測定,得檢測限為0.06μg/ml(信噪比為3:1)。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批號的樣品6份,按“2.2.2”項下方法配制供試品溶液,照上述色譜條件測定,測得維生素B12含量的RSD=0.98%,重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液按上述色譜條件測定,分別在0小時、1小時、4小時、6小時各取樣20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。測得維生素B12峰面積RSD=1.8%,結(jié)果表明,供試品溶液在室溫下避光放置6h穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗

取“2.2.1”項下對照品儲備液,分別精密量取0.8ml、1ml、1.2ml各三份,分別置50ml量瓶中,并按處方量100%加入輔料,用水稀釋至刻度,濾過。照上述色譜條件測定,記錄色譜圖,計算回收率。結(jié)果見表1。

2.9 樣品測定

取3批樣品,每批稱取2份,照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定。結(jié)果見表2。

3 討論

(1)現(xiàn)保健食品中維生素B12的測定是針對多成分,基質(zhì)相對復(fù)雜的樣品而制訂的。其測定原理是采用固相萃取法對試樣提取液中的維生素B12進行富集并去除部分雜質(zhì),供高效液相色譜儀分析。該方法前處理復(fù)雜,操作繁鎖,檢測周期長、所使用的部分試劑試藥具有毒性(三氯甲烷、四丁基氯化銨),檢驗成本高。其中經(jīng)凈化步驟的目的在于除去脂溶性干擾物質(zhì),如脂溶性維生素、油脂等;固相萃取步驟的目的是將B12進一步提純、富集到足夠的濃度,達到儀器檢測的靈敏度。如B族維生素片配方中不含脂溶性成分,且濃度較高,則無需進一步富集純化即可達到儀器檢測的靈敏度。本文中企業(yè)提供的樣品是由7種水溶性B族維生素與適宜的輔料制成,配方中不含脂溶性成分,維生素B12的含量為15～40mg/100g,故上述方法適用于此類產(chǎn)品的含量測定。

(2)對維生素B12溶液進行紫外掃描,在361nm波長處有最大吸收,故選擇361nm為檢測波長。

[1]庫姆斯,張丹參,杜冠華.維生素:營養(yǎng)與健康基礎(chǔ).第3版.北京:科學(xué)出版社,2009:322～323,369,385,449.

[2]GB/T 17819-1999《維生素預(yù)混料中維生素B12的測定高效液相色譜法》[S].