，，，

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院,山東 青島266003 1 腫瘤科； 2 中心實驗室)

食管癌是世界常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有30萬人死于食管癌，位居腫瘤死因第6位。目前，對食管癌的治療，早期以根治性手術為主，對食管癌尤其晚期病人化療仍占有非常重要的地位，但總有效率并不樂觀。因此，尋找對食管癌更有效的藥物和治療方法具有重要意義。目前認為紫杉醇(Paclitaxe)是治療食管癌最有效的藥物之一，單藥緩解率(RR)為32%[1]，是臨床上一線治療食管癌的藥物，但因毒副作用嚴重，其應用及療效受到了限制。大量實驗證實，綠茶提取物茶多酚(TP)可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[2-3],但TP對食管癌體外作用的報道少見。本研究以不同濃度的TP、Paclitaxel對食管癌Eca-109細胞分別進行單獨及聯(lián)合用藥，檢測TP、Paclitaxel對腫瘤細胞生長、細胞凋亡及凋亡相關調節(jié)基因Caspase-3表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及來源

Paclitaxel(相對分子質量853.92)，哈藥集團生物工程有限公司生產； TP(含量98%)，西安奧澤生物科技有限公司生產，用高純水配成濃度5 g/L溶液，直徑0.22 μm的濾器過濾，置于-20 ℃冰箱，避光保存?zhèn)溆?；RPMI-1640培養(yǎng)液與胎牛血清，均為Hycloneg公司產品；溴化噻唑藍四唑(MTT)，Sigma公司產品；AnnxineV/PI凋亡檢測試劑盒，購自碧云天生物技術研究所；Caspase-3引物[4](上游引物：5′-TGGAACAAATGGACCTGTTGACC-3′，下游引物：5′-AGGACTCAAATTCTGTTGCCACC-3′)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，預擴增片段為365 bp；逆轉錄PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司。內參照基因為GAPDH，上游引物: 5′-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3′, 下游引物：5′-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3′，預擴增片段為135 bp。

1.2 細胞培養(yǎng)

食管癌Eca-109細胞購于中國科學院上海細胞庫，用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(內含100 kU/L青霉素和100 kU/L鏈霉素)培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，當細胞融合至80%～90%時，進行細胞傳代。

1.3 細胞增殖抑制的檢測

采用MTT法。收集處于對數(shù)生長期的Eca-109細胞，以1×107/L的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng),等待細胞完全貼壁。將處于對數(shù)期的細胞隨機分為TP組、Paclitaxel組、兩藥聯(lián)合組，分別加入100 μL含不同濃度TP(125、250、500、1 000 mg/L)、Paclitaxel(0.2、1.0、5.0、25.0 mg/L)及TP+Paclitaxe(500 mg/L TP+1 mg/L Paclitaxel)的培養(yǎng)液，并設立陰性對照組、空白對照組，每組5個副孔。置于培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加150 μL MTT，避光培養(yǎng)4 h，將孔內液體吸出，再向每孔內加20 μL的二甲基亞砜，震蕩10 min，在酶標儀上測定490 nm處的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率(IR)。IR=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.4 細胞形態(tài)觀察

收集對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板，每孔2 mL、細胞數(shù)40×104，置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，等待細胞貼壁。將處于對數(shù)生長期的細胞隨機分為TP組(500 mg/L)、Paclitaxel組(1 mg/L)、 兩藥聯(lián)合組(TP 500 mg/L+1 mg/L Paclitaxel)組，對照組不加藥物，24 h后，顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)學變化。

1.5 細胞凋亡周期與細胞凋亡率檢測

1.5.1細胞凋亡周期的檢測 采用PI單染法。細胞處理及實驗分組同1.4，每組設3個副孔。收集細胞至離心管，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞，去上清。加入1 mL預冷體積分數(shù)0.70的乙醇，混勻，4 ℃固定24 h。離心，去上清，PBS洗滌。每管內加入PI 25 μL、RNaseA 10 μL，緩慢并充分重懸，400目篩網過濾，37 ℃避光溫浴30 min,流式細胞儀(美國B.D公司)檢測細胞周期的分布。

1.5.2細胞凋亡率的檢測 采用AnnxineV/PI雙染法。細胞處理及實驗分組同1.4，每組設3個副孔。收集細胞，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞，去上清，冷PBS洗滌。再離心，去上清，重懸細胞于100 μL 1×buffer中。加入AnnexinV 5 μL +PI1 μL，室溫下培育15 min。加入400 μL 1×buffer，充分重懸細胞，400目篩網過濾，用流式細胞儀(美國B.D公司)檢測細胞凋亡率。

1.6 Caspase-3 mRNA檢測

采用半定量逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)方法。細胞處理及實驗分組同1.4，藥物作用24 h后，收集細胞，加入TRIzol、氯仿、異丙醇、冰預冷體積分數(shù)0.75的乙醇提取細胞總RNA。取總RNA5 μL，在PCR儀上行逆轉錄反應。反應條件：65 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min變性，退火反應，45 ℃ 20 min，95 ℃ 5 min。取逆轉錄產物1 μL，引物0.4 μL，總反應液10 μL，在PCR儀上行逆轉錄反應：95 ℃5 min變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)。PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,以內參基因GAPDH作對照，應用圖像分析系統(tǒng)半定量分析Caspase-3 mRNA的表達。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 TP和Paclitaxel對Eca-109細胞IR的影響

隨著TP、Paclitaxel濃度升高和作用時間延長，細胞IR增加，差異有顯著性(F=134.46～423.75，P<0.05)。兩藥聯(lián)合組作用12、24、48 h，對細胞的IR分別明顯高于TP組、Paclitaxel組(q=8.63～26.96，P<0.05)。采用相互作用指數(shù)[5](CDI)評價兩藥的相互作用(CDI=AB/(A×B)，其中A、B是兩藥單獨作用吸光度值與對照組吸光度值的比值，AB為兩藥聯(lián)合組吸光度值與對照組吸光度值比值。CDI>1時，兩藥相互作用為拮抗作用；CDI=1，兩藥作用性質為相加；CDI<1時，兩藥相互作用為協(xié)同)。結果顯示，作用12、24、48 h，CDI值分別為0.91、0.89、0.85，兩藥有協(xié)同作用(圖3)。

2.2 TP和Paclitaxel對Eca-109細胞形態(tài)的影響

光鏡下，TP組、Paclitaxel組、兩藥聯(lián)合組細胞稀疏，形態(tài)變圓，細胞皺縮，染色質致密，細胞核固縮，胞質內有凋亡小體產生，兩藥聯(lián)合組表現(xiàn)更為明顯(圖4)。對照組細胞密集，貼壁生長，分裂旺盛，形態(tài)規(guī)則，呈鋪路石樣改變，細胞核位于細胞中部(圖5)。

2.3 TP和Paclitaxel對Eca-109細胞周期及凋亡率的影響

2.3.1細胞周期 TP、Paclitaxel及兩藥聯(lián)合誘導Eca-109細胞24 h后，細胞周期均發(fā)生明顯改變，G1期細胞數(shù)與對照組比較明顯增高(F=54.52,q=5.39～17.53,P<0.05)，而S期與G2期細胞比例減少。見表1。

2.3.2細胞凋亡率 TP組、Paclitaxel組、兩藥聯(lián)合組誘導24 h的Eca-109細胞凋亡率分別為(17.54±0.95)%、(10.27±0.93)%、(25.24±0.91)%，差異有統(tǒng)計學意義(F=446.82，q=16.27、31.64，P<0.05)。

2.4 TP和Paclitaxel 對食管癌Eca-109細胞Caspase-3 mRNA表達的影響

與TP組、Paclitaxel組比較，兩藥聯(lián)合組誘導24 h后，Eca-109細胞Caspase-3 mRNA的表達量分別增高17.22%、11.63%，差異有顯著意義(F=108.33，q=30.37、20.52，P<0.05)。見圖6。

3 討 論

食管癌是全世界高發(fā)惡性腫瘤之一，臨床確診時大多數(shù)病例已屬中晚期，化療在食管癌的治療中占重要地位。Paclitaxel為食管癌的臨床一線用藥，是治療食管癌最有效的藥物之一，但其毒副作用比較嚴重。在體外，TP可通過選擇性阻斷信號傳導通路、抑制尿酸氧化酶活性等多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。但TP對食管癌的體外作用以及TP聯(lián)合Paclitaxel對食管癌的作用國內罕見報道。

細胞增殖失控是惡性腫瘤重要的生物學特征。本文研究顯示，TP、Paclitaxel均能顯著抑制食管癌Eca-109細胞的增殖，并與時間、濃度呈正相關，這與有關文獻報道結果相似[7-8]。而當兩藥聯(lián)用時，對食管癌Eca-109細胞的IR明顯提高。光鏡及流式細胞儀均能觀察到細胞凋亡的發(fā)生，其中兩藥聯(lián)合組更加明顯。提示TP能抑制Eca-109細胞生長、誘導細胞凋亡，與Paclitaxel聯(lián)用能增強其抑制細胞生長、誘導細胞凋亡的作用。

凋亡是細胞的程序化死亡過程，如細胞凋亡受阻可導致腫瘤無限增殖。本文結果顯示，Eca-109細胞經TP、Paclitaxel及兩藥聯(lián)合作用后，均出現(xiàn)細胞周期阻滯，G1期細胞比例增高，也出現(xiàn)細胞凋亡，表明細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡可能也是TP、Paclitaxel抗腫瘤作用的重要機制之一。

表1 兩藥對Eca-109細胞周期的影響(n=3,χ/%)

圖1 TP對Eca-109細胞IR的影響

圖2 Paclitaxel對Eca-109細胞IR的影響

圖3 TP、Paclitaxel聯(lián)合對Eca-109細胞IR的影響

圖4 兩藥聯(lián)合組Eca-109細胞形態(tài) (×100)

圖5 對照組細胞形態(tài) (×100)

M為Marker;①、⑤對照組；②、⑥TP組；③、⑦Paclitaxel組；④、⑧兩藥聯(lián)合組。

細胞凋亡是非常復雜的蛋白酶級聯(lián)反應過程。目前認為藥物誘導腫瘤細胞的凋亡受一個或多個基因的調控[9]。眾所周知，Caspase-3為與細胞凋亡密切相關的蛋白酶家族[10]。誘導細胞凋亡的典型途徑包括：對Caspase-3的依賴性(細胞外途徑)和對線粒體靶向性(細胞內途徑)，而Caspase-3是兩種細胞凋亡途徑中的關鍵酶和執(zhí)行者，是級聯(lián)反應的必經之路[11-12]。Caspase-3由12 000和17 000大小兩個亞基構成，是編碼35 000大小半胱氨酸蛋白酶的基因。TP在誘導腫瘤細胞凋亡的過程中，具有對Caspase-3的依賴性和線粒體靶向性[13]。本文結果顯示，隨著細胞凋亡率增加，Caspase-3 mRNA表達增加，提示Caspase-3 mRNA的表達與細胞凋亡過程有關，但其信號傳導具體途徑仍不清楚，可能與Caspase-3的活化相關。由于活化的Caspase-3能特異性地切斷DNA，使參與DNA損傷修復過程中的DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)和聚ADP核糖聚合酶(PARP)失活，導致核酸激活和染色質聚集，促使細胞凋亡[14]。ODONKOR等[15]的研究結果表明，Caspase-3依賴性途徑是Paclitaxel細胞毒性作用的重要途徑，Caspase活化和效能對Paclitaxel治療腫瘤的敏感性具有良好的指示作用。本研究RT-PCR結果顯示，TP組、Paclitaxel組和兩藥聯(lián)合組Caspase-3表達均增高，兩藥聯(lián)合組作用更明顯，這與流式細胞術檢測結果一致，提示TP、Paclitaxel誘導細胞凋亡與上調Caspase-3表達有關。

綜上所述，TP和Paclitaxel不僅能抑制食管癌Eca-109細胞的分裂，阻滯細胞周期于G1期，使其增殖指數(shù)下降，從而抑制細胞的增殖，而且在一定的范圍內呈時間、濃度依賴性；同時，二者也可通過上調Caspase-3表達，誘導細胞凋亡，提示Caspase-3 mRNA表達與細胞的凋亡密切相關。但TP、Paclitaxel通過Caspase-3信號傳導通路途徑誘導細胞凋亡的具體機制并不清楚，尚需更深入的研究。

[1] AJANI J A, DAUGHERTY K. Activity of taxol in patients with squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of theesophagus[J]. Journal of the National Cancer Institute, 1994,86(14):1086-1091.

[2] 羅非君,胡智,趙曉榮,等. 茶多酚誘導鼻咽癌細胞cyclin D1表達下調[J]. 癌癥, 2001,20(4):358-362.

[3] 毛小強,那萬里,趙丹,等. 茶多酚對前列腺癌PC-3M細胞增殖與凋亡的影響[J]. 中國實驗診斷學, 2010,14(2):170-173.

[4] LI R, PEI H, PAPAS T. The p42

variant of ETS1 protein rescues defective Fas-induced apoptosis in colon carcinoma cells[J]. Immunology, 1999,96(7):3876-3881.

[5] CAO S S, ZHEN Y S. Potentiation of antimetabolite antitumor activity in vivo by dipyridamole and amphotericin B[J]. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 1989,24(3):181-186.

[6] 劉剛,陸勁松. 茶多酚對腫瘤防治作用的研究進展[J]. 中國癌癥雜志, 2002,12(3):74-77.

[7] JUDSON P L, WATSON J M, GEHRIG P A, et al. Cisplatin inhibits paclitaxel-induced apoptosis in cisplatin-resistant ova-rian cancer cell lines: possible explanation for failure of combination therapy[J]. Cancer Research, 1999,59(10):2425-2432.

[8] 孟顯峰,宋揚,楊偉品. IP6誘導肝癌細胞HepG2凋亡及其對Bcl-2和Bax蛋白表達影響[J]. 青島大學醫(yī)學院學報, 2011,47(4):311-313.

[9] 金鑫,姚良萍,盧云. 康萊特對HepG2細胞凋亡及其Caspase-3和Survivin表達影響[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2012,27(1):1-3.

[10] POP C, SALVESEN G S. Human caspases: activation, specificity, and regulation[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009,284(33):21777-21781.

[11] HASTAK K, AGARWALM K, MUKHTAR H, et al. Ablation of either p21 or Bax prevents P53-dependent apoptosis induced by green tea polyphenol epigallocatechin3-gallate[J]. Faseb Journal, 2005,19(7):789-791.

[12] ZOU H, HENZEL W J, LIU X, et al. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome C-dependent activation of caspase-3[J]. Cell, 1997,90(3):405-413.

[13] ODONKOR C A, ACHILEFU S. Differential activity of caspase-3 regulates susceptibility of lung and breast tumor cell lines to Paclitaxel[J]. The Open Biochemistry Journal, 2008,2(2):121-128.