王秀美 侯先志* 敖長金 高 民 考桂蘭 高愛武 蘭儒冰 塔 娜

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010010;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018)

在奶牛的乳腺中，乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)增殖、分化和消退的過程，隨著奶牛不同的生理期而循環(huán)往復(fù)，進(jìn)而影響奶牛的泌乳［1－4］，因此了解BMECs這一周期性變化的規(guī)律、條件及機制，對于提高奶牛的產(chǎn)奶量有重要意義。但動物體內(nèi)試驗一般試驗周期長、耗費大又難以控制機體復(fù)雜環(huán)境因子的相互影響，故一般采用體外培養(yǎng)來研究。目前BMECs體外培養(yǎng)常用的是二維培養(yǎng)，在二維培養(yǎng)的條件下BMECs所形成的形態(tài)結(jié)構(gòu)與體內(nèi)形成的網(wǎng)絡(luò)管腔和腺泡結(jié)構(gòu)相差較大。細(xì)胞的功能與其特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性，這使得在利用二維培養(yǎng)研究奶牛泌乳調(diào)控時，細(xì)胞有些功能不能得到發(fā)揮。在三維培養(yǎng)體系中，BMECs經(jīng)歷連續(xù)增殖和遷移聚集，最終形成一個完整的類腺泡結(jié)構(gòu)［5］，該結(jié)構(gòu)與體內(nèi)形成的網(wǎng)絡(luò)管腔和腺泡結(jié)構(gòu)相似。但是國內(nèi)外關(guān)于BMECs三維培養(yǎng)的研究較少，對于三維培養(yǎng)適宜時間的研究還未見報道。已有BMECs三維培養(yǎng)的研究中，由于研究者們采用的細(xì)胞來源、基質(zhì)類型、接種方式不同，對三維培養(yǎng)模式下BMECs腺泡結(jié)構(gòu)形成時間有不同結(jié)論［5－14］。綜上所述，體外培養(yǎng)條件下，類腺泡結(jié)構(gòu)的形態(tài)與泌乳相關(guān)基因表達(dá)密切關(guān)聯(lián)［15－17］。BMECs只有形成完整的腺泡結(jié)構(gòu)時，才能反映機體內(nèi)乳腺泌乳狀態(tài)，研究乳腺腺泡結(jié)構(gòu)的形成時間尤為關(guān)鍵。本試驗通過檢測BMECs αs1－酪蛋白、β－酪蛋白及κ－酪蛋白基因表達(dá)量的變化，旨在確定三維模式下，未經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMECs的最佳培養(yǎng)時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 乳腺組織

在內(nèi)蒙古地區(qū)選取3頭健康的3～5歲泌乳黑白花奶牛的乳腺組織。

1.1.2 試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基成分為:DMEM/F12(美國Gibco公司)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉(ITS，美國Sigma公司)、表皮生長因子(EGF，美國Sigma公司)、氫化可的松(He，美國 Sigma公司)、催乳素(prolactin，美國 Sigma公司)、胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)和基質(zhì)(matrigel，美國 Gibco公司)。

終止培養(yǎng)基為DMEM/F12的基礎(chǔ)上添加10%的FBS;生長培養(yǎng)基為DMEM/F12的基礎(chǔ)上添 加 FBS、ITS、EGF、He;貼 壁 培 養(yǎng) 基 為DMEM/F12的基礎(chǔ)上添加 FBS、ITS、He、基質(zhì);分化培養(yǎng)基為DMEM/F12的基礎(chǔ)上添加ITS、He、基質(zhì)、催乳素。細(xì)胞培養(yǎng)基組成見表1。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)基組成Table 1 Composition of the medium for cell culture mL

組織消化所用的溶液:0.5%的Ⅱ型膠原酶(北京康倍斯科技有限公司)溶液。

細(xì)胞消化所用的溶液:0.25%胰蛋白酶(北京康倍斯科技有限公司)、0.02%的乙二胺四乙酸(EDTA，北京康倍斯科技有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，美國 HyClone公司)、雙抗(青霉素 －鏈霉素，雙抗在溶液中的終濃度為100 U/mL，美國HyClone公司)。

酪蛋白基因表達(dá)的測試試劑如下:總RNA提取試劑盒 RNAiso Plus(日本 TaKaRa公司)、PrimeScriptRT Master Mix perfect Real Time試劑盒(日本TaKaRa公司)、SYBRPremix Ex TaqrTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)、細(xì)胞回收液(美國BD公司)、氯仿、異丙醇、75%無酶乙醇(天津市登科化學(xué)試劑有限公司)等。

試驗所用的主要儀器如下:高壓滅菌鍋(日本TOMY公司)、超聲波清洗機(昆山超聲波儀器有限公司)、倒置相差顯微鏡(香港麥克迪公司)、CO2培養(yǎng)箱(香港力康公司)、超凈工作臺(江蘇蘇凈公司)、實時定量PCR儀(美國ABI公司)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

本試驗采集了3頭健康的3～5歲泌乳期的黑白花奶牛的乳腺細(xì)胞。采用三維模式培養(yǎng)3、5、7、9 d后回收細(xì)胞，每頭牛的乳腺細(xì)胞，每個時間點設(shè)2個重復(fù)，回收的細(xì)胞用于測定酪蛋白基因的表達(dá)量。

1.2.2 試驗所需乳腺組織樣品的采集

奶牛屠宰后迅速進(jìn)行乳腺組織樣品的采集，用75%的酒精將乳腺組織的中上部進(jìn)行消毒，然后用無菌的手術(shù)剪、手術(shù)刀和鑷子進(jìn)行樣品的采集。采集的乳腺組織約為50 g，采集的乳腺組織要求腺泡豐富、導(dǎo)管和脂肪較少。將其用無菌PBS(雙抗的濃度為300 U/mL)沖洗至無明顯的乳汁溢出，然后放入有無菌PBS(雙抗的濃度為300 U/mL)的藍(lán)蓋瓶內(nèi)，保持溫度在－4℃左右迅速帶回實驗室，進(jìn)行后續(xù)試驗操作。

1.2.3 BMECs的原代培養(yǎng)

將采集的乳腺組織放入含有75%酒精的燒杯內(nèi)清洗約30 s，然后依次用無菌PBS(雙抗的濃度為100 U/mL)清洗3次，用無菌的眼科剪去除酒精浸泡過的外層組織，得到新鮮的組織樣品。然后去除脂肪、結(jié)締組織和殘留的管腔結(jié)構(gòu)。將符合上述要求的乳腺組織剪碎為直徑1～2 mm的顆粒。將這些顆粒用無菌PBS(雙抗的濃度為100 U/mL)清洗2～3次至洗液清亮，然后取適量清洗過的顆粒移入10 mL刻度離心管內(nèi)，向離心管內(nèi)加入0.5%的Ⅱ型膠原酶溶液，酶的加入量是組織樣品體積的3倍，置于37℃、5%CO2飽和的培養(yǎng)箱中，消化1.0～1.5 h得到組織細(xì)胞混合液。

將消化1.0～1.5 h的組織細(xì)胞混合液用100目(孔徑)的無菌尼龍濾網(wǎng)過濾，將細(xì)胞濾液轉(zhuǎn)移至10 mL錐底刻度離心管中。于128×g離心8 min，棄去上清液。然后向離心管內(nèi)加入生長培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞和生長培養(yǎng)基的混合液接種于75 cm2一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2飽和的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 二維模式下BMECs的分離、純化

二維培養(yǎng)能夠為三維培養(yǎng)提供足夠數(shù)量較高純度的BMECs，所以BMECs三維培養(yǎng)前先進(jìn)行二維培養(yǎng)。

本試驗中所用的BMECs的接種、分離及純化的方法參見王秀美等［6］的方法。

1.2.5 二維模式下BMECs的鑒定

將洗凈滅菌的小玻璃片放入6 cm培養(yǎng)皿中，接種細(xì)胞，待細(xì)胞長到70%～80%時取出玻璃片，用PBS清洗3次。室溫下用4%多聚甲醛固定30 min，再用含0.2%TritonX-100通透處理細(xì)胞10 min，PBS清洗3次，每次5 min。用含1%明膠的PBS封閉處理30 min。然后用鼠抗人角蛋白18(CK-18)單克隆抗體(1∶50稀釋)，于室溫下振蕩孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min。加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(1∶50)，室溫下避光振蕩孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min。再加入含碘化丙錠(PI)10μg/mL的PBS，室溫下染色10 min。用倒置相差熒光顯微鏡觀察結(jié)果，同時用牛成纖維細(xì)胞作陰性對照。

如果待檢細(xì)胞中具有CK-18，則FITC標(biāo)記的二抗可以和一抗特異性結(jié)合，呈綠色，顯示被檢測抗原的位置，即CK-18的位置。同時，PI可以使細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色。

1.2.6 BMECs的三維培養(yǎng)

1.2.6.1 三維培養(yǎng)基質(zhì)的準(zhǔn)備

將基質(zhì)放置于4℃內(nèi)12 h，然后將基質(zhì)鋪入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔的加膠量為1 mL，上述鋪膠的操作均在冰上進(jìn)行。然后將6孔板置于培養(yǎng)箱內(nèi)，約30 min膠凝固，膠凝固后將BMECs懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。

1.2.6.2 三維培養(yǎng)用 BMECs的準(zhǔn)備

將1.2.4所述二維培養(yǎng)純化的第1代BMECs用PBS懸浮，然后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計數(shù)足夠的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的10 mL離心管內(nèi)，于128×g離心8 min，棄去上清液。加入貼壁培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀懸浮(細(xì)胞密度為1×106mL－1)備用。

1.2.6.3 BMECs的接種

BMECs的三維培養(yǎng)參照 Kozlowski等［5］的方法進(jìn)行，本試驗在該方法基礎(chǔ)上，對細(xì)胞的生長濃度、鋪膠量及血清濃度進(jìn)行了調(diào)整，具體接種過程如下:將1.2.6.2 所述密度為 1 ×106mL－1的上皮細(xì)胞懸液接種于包被了基質(zhì)的6孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液的量為2 mL。然后將6孔板置于37℃、5%CO2飽和的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況進(jìn)行換液，換液所用培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基，每天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并拍照。分別培養(yǎng)3、5、7、9 d時，進(jìn)行酪蛋白基因表達(dá)量的測定。

1.2.7 三維培養(yǎng)的BMECs酪蛋白基因表達(dá)量的測定

1.2.7.1 總 RNA 提取

三維培養(yǎng)的細(xì)胞分別于培養(yǎng)3、5、7、9 d進(jìn)行總RNA的提取，首先進(jìn)行三維培養(yǎng)細(xì)胞的回收，回收方法參見細(xì)胞回收液說明書。將回收得到的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗2次，然后離心，加入適量RNAiso Plus。將細(xì)胞和裂解液混合物轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管內(nèi)，總RNA的提取步驟參見RNAiso Plus的說明書。提取的總RNA用核酸測定儀測定吸光度值(OD)及濃度，然后將提取的總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1.2%)電泳，以鑒定總RNA的完整性。將符合要求的總RNA于－70℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7.2 反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR

反轉(zhuǎn)錄:將三維培養(yǎng)的BMECs中提取的總RNA分別以相同的濃度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的具體步驟參見試劑盒說明書，反應(yīng)體系中包括:5×PrimeScriptRT Master Mix 5 μL，總 RNA 2.5 μL，RNase-free水17.5 μL，總體積為 25 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為:37℃ 15 min，然后85℃ 5 s。

實時定量PCR:引物序列見表2。PCR反應(yīng)按照試劑盒說明進(jìn)行。反應(yīng)體系中包括:SYBRPremix Ex TaqrTMⅡ (2×)10 μL，PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL，PCR Reverse Primer(10μmol/L)0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，cDNA(＜100 ng)2 μL，滅菌蒸餾水6.0μL，反應(yīng)體系的總體積20μL。擴(kuò)增條件:95 ℃，30 s;95 ℃，5 s，61 ℃，20 s，72 ℃，15 s，共45個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后自動分析熔解曲線，確定PCR產(chǎn)物的特異性。將各基因的實時定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，進(jìn)一步驗證擴(kuò)增片段的特異性和擴(kuò)增片段長度。

表2 實時定量PCR引物Table 2 Primers for the RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實時定量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法參照Livak等［18］的方法進(jìn)行，采用 2－△△Ct法表示，數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS 18.0中的ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 二維模式下BMECs的鑒定

應(yīng)用細(xì)胞熒光免疫染色法對分離純化培養(yǎng)的BMECs的骨架蛋白CK-18進(jìn)行了分析，經(jīng)檢測所培養(yǎng)的BMECs呈強陽性，陰性對照的奶牛成纖維細(xì)胞呈陰性。結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞是BMECs。

2.2 三維模式下不同培養(yǎng)天數(shù)BMECs的形態(tài)

經(jīng)三維培養(yǎng)的細(xì)胞用倒置相差顯微鏡(100×)進(jìn)行觀察，本試驗中三維培養(yǎng)的BMECs在培養(yǎng)1 d時就可以觀察到有類腺泡結(jié)構(gòu)的形成(圖1－A)。培養(yǎng)3 d時可以觀察到有類腺泡和管腔結(jié)構(gòu)的形成(圖1－B)。培養(yǎng)4 d時可以觀察到清晰的類腺泡結(jié)構(gòu)和管腔枝杈形態(tài)(圖1－C)。培養(yǎng)9 d時可以觀察到類腺泡結(jié)構(gòu)和管腔枝杈形態(tài)依然存在，但基質(zhì)不平整，有的腺泡結(jié)構(gòu)有自膠面上脫落的趨勢(圖1－D)。

2.3 三維模式下不同培養(yǎng)天數(shù)BMECs酪蛋白基因表達(dá)量

由表3可見，利用三維模式培養(yǎng)5 d的BMECs的αs1－酪蛋白和κ－酪蛋白基因表達(dá)量極顯著高于培養(yǎng)3、7、9 d(P ＜0.01)。利用三維模式培養(yǎng)5 d的BMECs的β－酪蛋白的基因表達(dá)量極顯著高于培養(yǎng)3、7 d(P＜0.01)，而與培養(yǎng)9 d的BMECs的β－酪蛋白的基因表達(dá)量差異不顯著(P ＞0.05)。

3 討論

在細(xì)胞表面的受體蛋白、細(xì)胞自分泌因子及激酶等會影響細(xì)胞在三維基質(zhì)中的遷移速度及形態(tài)的形成［19－20］。在細(xì)胞和細(xì)胞之間存在著緊密連接蛋白，包括鈣結(jié)合蛋白、整合素及免疫球蛋白家族等。所有這些都直接或間接地與肌動蛋白或是微絲細(xì)胞骨架相互作用，進(jìn)而提供機械動力使細(xì)胞發(fā)生移動，使鈣結(jié)合蛋白和細(xì)胞之間的連接能夠迅速地發(fā)生變化，因此使細(xì)胞之間發(fā)生重排，允許細(xì)胞之間的位置變化，鈣結(jié)合蛋白連接對細(xì)胞枝杈形態(tài)和管腔結(jié)構(gòu)的形成是重要的［21－26］。因此在這些因素的作用下細(xì)胞在基質(zhì)中經(jīng)歷不斷的增殖和遷移聚集，形成一個生長停滯的類腺泡結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上該結(jié)構(gòu)內(nèi)部細(xì)胞不斷的凋亡，最終形成一個由一層極化的上皮細(xì)胞組成的、有中空內(nèi)腔的類腺泡結(jié)構(gòu)［5］。本試驗中三維培養(yǎng)的BMECs也遵循這樣的規(guī)律，在培養(yǎng)1 d時可以觀察到有類腺泡結(jié)構(gòu)的形成，到培養(yǎng)3 d時就可以觀察到有類腺泡和管腔結(jié)構(gòu)的形成，培養(yǎng)4 d時可以觀察到清晰的類腺泡結(jié)構(gòu)和管腔、枝杈形態(tài)。本試驗中三維培養(yǎng)所形成的結(jié)構(gòu)與相關(guān)文獻(xiàn)報道的三維細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果相似［5，27］。該形態(tài)的形成使細(xì)胞的極化結(jié)構(gòu)得以實現(xiàn)，使細(xì)胞表面的受體的活性部位得以暴露，使調(diào)控通路得到實現(xiàn)，細(xì)胞表面的受體從而與周圍的環(huán)境更加有效作用，為激素的調(diào)控提供了條件。有些激素是轉(zhuǎn)錄信號通路的調(diào)控因子，影響細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄［28－29］。由此可見，形態(tài)的形成和維持與細(xì)胞的功能性是密切相關(guān)的，本試驗中BMECs培養(yǎng)4 d時形成了完整的類腺泡結(jié)構(gòu)和管腔、枝杈結(jié)構(gòu)，這可能與BMECs 3種酪蛋白基因的表達(dá)量的極顯著提高有關(guān)。本試驗中BMECs培養(yǎng)7 d的酪蛋白的基因表達(dá)量極顯著低于培養(yǎng)5 d。有研究表明，細(xì)胞完整的類腺泡和管腔枝杈結(jié)構(gòu)形成后，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，BMECs類腺泡結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞的數(shù)量在減少［27］。同時有研究表明，αs1－酪蛋白的合成和分泌除了受到基質(zhì)條件和激素的影響外，還受最小細(xì)胞密度的影響，當(dāng)?shù)陀谶@個最小細(xì)胞的密度時細(xì)胞將不會分泌。而αs1－酪蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上是否會受到細(xì)胞密度的影響，未見有文獻(xiàn)報道。在本試驗中從發(fā)育完全的腺泡結(jié)構(gòu)的發(fā)展過程可見，培養(yǎng)9 d的細(xì)胞密度將低于培養(yǎng)5 d，這主要是因為體外培養(yǎng)的BMECs腺泡結(jié)構(gòu)的形成退化過程和體內(nèi)相近，完整腺泡形成后，維持一定的時間細(xì)胞就開始凋亡，腺泡結(jié)構(gòu)不再完整。同時在體內(nèi)BMECs的凋亡時期是在乳腺回縮期，這個時期乳鐵蛋白的合成會增加，而乳鐵蛋白的增加會降低酪蛋白的合成［30－31］。這些可能是本試驗條件下培養(yǎng)5 d的BMECsαs1－酪蛋白和κ－酪蛋白2種酪蛋白基因的表達(dá)量顯著高于培養(yǎng)7 d的原因。BMECs形成的類腺泡和管腔枝杈結(jié)構(gòu)在本試驗條件下維持到培養(yǎng)9 d，到培養(yǎng)9 d時可以觀察到類腺泡結(jié)構(gòu)和管腔枝杈形態(tài)依然存在，但基質(zhì)不平整，有的腺泡結(jié)構(gòu)有自膠面上脫落的趨勢。BMECs是貼壁生長的細(xì)胞，細(xì)胞自膠面上脫落，可能是因為部分細(xì)胞死亡。而完整的腺泡結(jié)構(gòu)是由一層極化的上皮細(xì)胞組成的有中空內(nèi)腔的類腺泡結(jié)構(gòu)，但是到培養(yǎng)9 d，這層極化的上皮細(xì)胞有部分死亡，這一結(jié)構(gòu)不能維持。有研究認(rèn)為當(dāng)BMECs在基質(zhì)中至培養(yǎng)10 d時，已經(jīng)不具備完整的腺泡結(jié)構(gòu)［32］，同時也有研究報道體外培養(yǎng)的BMECs在激素的調(diào)控下也遵循體內(nèi)腺泡的增殖、分化和凋亡的規(guī)律［5］。因為BMECs有這樣的生理特性，BMECs在體外培養(yǎng)條件下，類腺泡結(jié)構(gòu)和管腔枝杈形態(tài)不能夠一直維持下去。而類腺泡和管腔枝杈結(jié)構(gòu)是BMECs某些功能表現(xiàn)的必要條件，這可能是本試驗條件下培養(yǎng)5 d的BMECsαs1－酪蛋白、β－酪蛋白和κ－酪蛋白基因的表達(dá)量高于培養(yǎng)9 d的原因。

圖1 三維模式下不同培養(yǎng)天數(shù)BMECs的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphous of BMECs in three-dimensional culture for different days(100 × )

表3 三維模式下不同的培養(yǎng)天數(shù)BMECs酪蛋白基因表達(dá)量Table 3 Expression levels of casein genes in BMECs in three-dimensional culture for different days

4 結(jié)論

三維模式下培養(yǎng)時間影響B(tài)MECs中αs1－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白的基因表達(dá)量。根據(jù)本試驗，三維模式下BMECs的適合培養(yǎng)時間為5 d。

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