李志華 付京花 唐雪蓮 侯夢(mèng)杰 吳海斌 潘 慶

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642)

近年來(lái)，營(yíng)養(yǎng)素被用作免疫增強(qiáng)劑以防治疾病的發(fā)生和降低疾病感染［1］。維生素E是水產(chǎn)動(dòng)物飼料中最重要的營(yíng)養(yǎng)素之一，特別是在高密度的養(yǎng)殖條件下顯得尤為重要。維生素E與水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體的新陳代謝、抗氧化能力、免疫功能、繁殖性能都有著密切的關(guān)系。它通過(guò)提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性、抑制自由基的形成、加快受損脫氧核糖核酸的清除等途徑減輕自由基對(duì)細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸、富含巰基的蛋白質(zhì)及細(xì)胞骨架和核酸的損傷［2－3］，從而使得水產(chǎn)動(dòng)物保持正常的生理狀況。已有的研究發(fā)現(xiàn)，維生素E能促進(jìn)鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)［4］、大菱鲆(Scophthalmus maximus)［5］的生長(zhǎng)，高于 NRC(2011)推薦量的高水平維生素E能顯著提高斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)［6］、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)［7］的生長(zhǎng)性能，并提高其體內(nèi)抗氧化酶的活性。但過(guò)高水平維生素E會(huì)降低許氏平的生長(zhǎng)速度和血色素濃度［8］。過(guò)量的維生素E導(dǎo)致香魚(yú)紅細(xì)胞脆性增強(qiáng)，并且促進(jìn)體內(nèi)的脂肪過(guò)氧化［9］。這些研究結(jié)果提示，過(guò)量的維生素E可能對(duì)魚(yú)類(lèi)具有毒性作用。本研究旨在運(yùn)用營(yíng)養(yǎng)學(xué)和毒理學(xué)的方法，對(duì)維生素E作為抗氧化飼料添加劑的有效性和羅非魚(yú)對(duì)其的耐受性進(jìn)行評(píng)價(jià)，獲得其最大未觀察到有害作用劑量(no observed adverse effect level，NOAEL)，以確定維生素E發(fā)揮最佳功效并不致對(duì)機(jī)體產(chǎn)生副作用的最大劑量，從而為羅非魚(yú)飼料中合理有效地應(yīng)用維生素E的抗氧化性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)和維生素E

試驗(yàn)用吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)購(gòu)于廣州番禺國(guó)家羅非魚(yú)良種場(chǎng)。試驗(yàn)用維生素E購(gòu)自Sigma公司，活性成分為α－生育酚，為微黃綠色黏稠液體，維生素E含量≥96%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用400尾大小均勻［平均體重為(3.25 ±0.02)g］、健康的吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)，隨機(jī)分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾。5組(G0、G1、G2、G3、G4)試驗(yàn)飼料維生素 E 添加量分別為0(對(duì)照)、25、50、250、2 500 mg/kg，測(cè)得維生素 E 實(shí)際含量分別為 8.5、33.0、56.0、220.0、2 580.0 mg/kg，試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。有效劑量50 mg/kg依據(jù)NRC(2011)和相關(guān)文獻(xiàn)推薦的羅非魚(yú)對(duì)維生素 E 的需要量［7，10－11］確定，最高劑量為有效劑量的50倍。劑量設(shè)計(jì)原則依據(jù)農(nóng)業(yè)部《飼料和飼料添加劑水產(chǎn)靶動(dòng)物有效性和耐受性評(píng)價(jià)試驗(yàn)指南》和歐盟 EFSA［12］標(biāo)準(zhǔn)。飼料原料經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩，于攪拌機(jī)中混勻30 min，邊攪拌邊緩慢加入豆油和魚(yú)油，然后再加入30%的水，最后用雙螺旋擠壓機(jī)擠壓成直徑1.5 mm的面條狀，再制成粒狀飼料，自然風(fēng)干后，保存于－20℃的冰柜中備用。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)過(guò)濾水族箱(68 cm×48 cm×42 cm，容積約130 L)中進(jìn)行，試驗(yàn)魚(yú)暫養(yǎng)14 d，期間投喂G0組飼料。馴化結(jié)束后，將試驗(yàn)魚(yú)(初始體重約為3.25 g)隨機(jī)分配到20個(gè)水族箱中，每箱20尾，每天定時(shí)定量投喂飼料2次，前4周投飼率為體重的4%，后4周投飼率為體重的5%。水源為曝氣自來(lái)水。試驗(yàn)期間水溫為(26.6± 1.2)℃，pH 7.40 ～ 7.80，溶 解 氧 ＞5.0 mg/L，氨氮 ＜0.3 mg/L。每天定時(shí)吸污、換水，換水量為水族箱的1/3。試驗(yàn)期56 d。

1.4 樣品采集

生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h進(jìn)行稱重，然后分別采集羅非魚(yú)的肝臟與血清。每箱隨機(jī)選取6尾規(guī)格一致的試驗(yàn)魚(yú)，丁香酚麻醉后解剖取肝胰臟，液氮速凍，－80℃保存。另從每箱中取8尾，尾靜脈取血，在3 h內(nèi)完成取血，將血液靜置3 h，以5 400 r/min離心15 min，取血清，－80℃保存，用于抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。將保存于－80℃的組織樣品在冰上解凍，取組織塊約1 g在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，放入勻漿玻璃管中，按1 g樣品10 mL的比例加入0.68%冰凍生理鹽水，用玻璃勻漿機(jī)1.1×104r/min勻漿2次，每次 30 s，后將組織勻漿液在 4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液，－80℃保存。

1.5 計(jì)算與分析

1.5.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)計(jì)算

1.5.2 飼料營(yíng)養(yǎng)成分分析

飼料水分含量采用105℃烘箱干燥法(GB/T 6435—1986)測(cè)定;粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)測(cè)定;粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994)測(cè)定;粗灰分含量采用550℃灼燒法(GB/T 6438—1992)測(cè)定;維生素E含量采用高效液相色譜法(JY/T 024—1996)測(cè)定。

1.5.3 生化指標(biāo)分析

采用羥胺法、鉬酸銨法、比色法及芬頓(Fenton)反應(yīng)測(cè)定羅非魚(yú)肝胰臟與血清超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)、羥自由基(·OH)含量，所有指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測(cè)，相應(yīng)操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行one-way ANOVA方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表2可見(jiàn)，G4組羅非魚(yú)幼魚(yú)增重率、特定生長(zhǎng)率均低于其他各組，并與G1、G3組達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，表現(xiàn)出一定的毒性效應(yīng)。在其他組中，隨著維生素E添加量的提高，增重率、特定生長(zhǎng)率呈上升趨勢(shì)。G3組羅非魚(yú)幼魚(yú)增重率、特定生長(zhǎng)率顯著高于其他4組(P＜0.05)。除G3組外，各組的飼料效率差異不顯著(P＞0.05)。與G0組相比，各組的存活率都得到提高，其中G2、G4組顯著高于 G0組(P＜0.05)，而其他各組之間差異不顯著(P＞0.05)。一定劑量的維生素E能夠顯著提高羅非魚(yú)幼魚(yú)的攝食及生長(zhǎng)，當(dāng)添加量達(dá)到最適攝入量的50倍時(shí)，可能會(huì)在一定程度上抑制其生長(zhǎng)。

2.2 維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)抗氧化酶活性的影響

由表3可見(jiàn)，血清和肝胰臟中的SOD活性均隨著飼料中維生素E添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，G4組羅非魚(yú)幼魚(yú)的SOD活性出現(xiàn)大幅下降。在血清中，G4組SOD活性顯著低于G2、G3組(P＜0.05)，與 G0、G1組差異不顯著(P ＞0.05)。在肝胰臟中，G4組SOD活性顯著低于G2組(P＜0.05)，與其他3組差異不顯著(P＞0.05)。血清CAT活性也隨飼料中維生素E添加量增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，以G2組最高;G4組顯著低于 G2組(P＜0.05)，顯著高于 G0、G1組(P ＜0.05)，與 G3組差異不顯著(P ＞0.05)。肝胰臟CAT活性也以G2組最高，G4組顯著低于G2組(P＜0.05)，與其他3組差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)生化指標(biāo)的影響

由表4可見(jiàn)，飼料不同的維生素E添加量對(duì)羅非魚(yú)肝胰臟維生素E含量產(chǎn)生了一定的影響，表現(xiàn)為 G2、G3、G4組顯著高于 G0、G1組(P＜0.05)，而G0與G1組差異不顯著(P＞0.05)。血清和肝胰臟的MDA含量均隨維生素E添加量的增加而下降，G3和G4組顯著低于G0和G1組(P＜0.05)。除了G1組，血清羥自由基含量在其他4組間差異不顯著(P＞0.05)。肝胰臟羥自由基含量以 G4組最低，顯著低于 G0、G1、G2組(P ＜0.05)，與 G3組差異不顯著(P ＞0.05)。

表2 維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of dietary vitamin E on growth performance of juvenile tilapia

表3 維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)血清和肝胰臟中SOD、CAT活性的影響Table 3 Effects of dietary vitamin E on activities of SOD and CAT in serum and hepatopancreas of juvenile tilapia

表4 維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)血清和肝胰臟中丙二醛、羥自由基和維生素E含量的影響Table 4 Effects of dietary vitamin E on contents of MDA，·OH and vitamin E in serum and hepatopancreas of juvenile tilapia

3 討論

3.1 飼料中維生素E的適宜添加水平

目前大多數(shù)試驗(yàn)中所確定的維生素E需求量是指試驗(yàn)期內(nèi)魚(yú)類(lèi)不出現(xiàn)缺乏癥狀的最低需求量，只有少數(shù)試驗(yàn)是采用最佳生長(zhǎng)或最佳免疫狀態(tài)時(shí)維生素 E的適宜需求量［13－15］。越來(lái)越多的研究表明，高于最低需求量數(shù)倍的維生素E對(duì)水生動(dòng)物具有促生長(zhǎng)和提高免疫力的作用。南亞野鯪攝食150 mg/kg維生素E(5倍NRC需求量)時(shí)，其增重率達(dá)到最大值［13］。幼建鯉攝食1 500 mg/kg維生素E(15倍 NRC需求量)時(shí)，其增重率、白細(xì)胞吞噬率分別達(dá)到最大值［16］。Paul等［14］給幼印鯪投喂5個(gè)添加水平維生素E的飼料12周后，用折線法確定其最佳增重率所需維生素E水平為99 mg/kg(4倍NRC需求量)。

然而魚(yú)體對(duì)維生素E的營(yíng)養(yǎng)需求存在一個(gè)適宜的劑量范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)維生素E具有營(yíng)養(yǎng)作用，而在這個(gè)范圍之外可能會(huì)引起生長(zhǎng)抑制、缺乏或中毒。因?yàn)榫S生素E是脂溶性維生素，與水溶性維生素不同，動(dòng)物攝入過(guò)量的脂溶性維生素，不能在短時(shí)間內(nèi)代謝并排出體外，會(huì)在體內(nèi)積累，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)進(jìn)行8周后，G0組的成活率低于其他各組，維生素E添加量最高的G4組則出現(xiàn)增重率、特定生長(zhǎng)率低于其他組的現(xiàn)象，生長(zhǎng)性能表現(xiàn)最好的為G3組。這與周顯青等［18］、張瓊［16］研究結(jié)果相似。維生素 E缺乏固然會(huì)使魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)緩慢，但同時(shí)維生素E過(guò)量也不利于魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)，并可能對(duì)魚(yú)體有毒害作用，因此需要研究魚(yú)類(lèi)對(duì)維生素E的最適需要量。

3.2 維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)抗氧酶活性的影響

SOD、CAT是生物體內(nèi)2種十分重要的具有抗氧化作用的酶，是生物體抗氧化防御系統(tǒng)中的重要成員。SOD是一種金屬酶(輔基為金屬離子)，能有效地清除超氧陰離子自由基，以保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受攻擊，而CAT能將SOD清除活性氧時(shí)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫(H2O2)轉(zhuǎn)化為水(H2O)，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活。大量研究表明，維生素E能夠提高抗氧化酶的活性［19－21］。本試驗(yàn)結(jié)果與前人一致，與G0組相比，G2、G3組羅非魚(yú)幼魚(yú)血清和肝胰臟中SOD與CAT活性得到顯著提高。但是當(dāng)維生素E添加量達(dá)到2 500 mg/kg時(shí)，機(jī)體的抗氧化狀態(tài)在大劑量維生素E作用下出現(xiàn)了變化，與G2、G3組相比，血清和肝胰臟的SOD、CAT活性均明顯下降。

因此，我們認(rèn)為低劑量的維生素E具有誘導(dǎo)產(chǎn)生抗氧化酶的能力，而過(guò)大劑量的維生素E則會(huì)抑制抗氧化酶的活性。Andersen［22］對(duì)大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過(guò)大劑量維生素E作用于大鼠時(shí)，骨髓中的不成熟細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化水平會(huì)減少，這個(gè)情況使得某些抗氧化酶在未成熟細(xì)胞中表達(dá)下降，進(jìn)而導(dǎo)致抗氧化酶活性下降。至于在魚(yú)類(lèi)中，維生素E與抗氧化酶是否也存在相似的劑量效應(yīng)則需要進(jìn)一步的探討，特別是分子水平上的研究。

3.3 飼料中維生素E對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化及肝胰臟維生素E含量的影響

本研究中，飼料中的維生素E添加量顯著影響魚(yú)體肝胰臟中的維生素E含量，隨著飼料中維生素E添加量的增加，羅非魚(yú)幼魚(yú)肝胰臟中維生素E含量也相應(yīng)增加。這與張永明等［23］對(duì)大鼠，Bai等［24］對(duì)許氏平，周顯青等［18］對(duì)中華鱉幼鱉的研究是一致的。肝胰臟是機(jī)體最重要的器官之一，被稱為機(jī)體內(nèi)部的“加工廠”，對(duì)機(jī)體自身的解毒功能和代謝功能起至關(guān)重要的作用。有研究表明，飼料中過(guò)大劑量的添加劑會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，而這種損傷往往會(huì)首先表現(xiàn)在肝胰臟組織結(jié)構(gòu)上［25－26］。由于樣品處理不當(dāng)，本試驗(yàn)并沒(méi)有做出羅非魚(yú)肝胰臟組織橫切圖。

維生素E是最有效的生物抗氧化劑之一，能夠與自由基反應(yīng)，中斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，因而組織中較高的維生素E含量往往能夠有效阻止組織中的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)［27］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著維生素E添加量的增加，羅非魚(yú)幼魚(yú)肝胰臟中維生素E含量逐漸升高，羥自由基的含量逐漸下降。這說(shuō)明羅非魚(yú)肝胰臟所承受的抗氧化壓力有所減輕。MDA是多不飽和脂肪酸氧化降解的主要產(chǎn)物之一。因而MDA可以用來(lái)反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度及間接反映細(xì)胞損傷的程度，并且MDA也是評(píng)價(jià)維生素E在抑制組織脂質(zhì)過(guò)氧化有效性的一個(gè)指標(biāo)［28－29］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中維生素E添加量升高可以使得魚(yú)體中MDA含量顯著降低，提示飼料中添加維生素E能夠有效抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，從而減輕脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)細(xì)胞的損傷。蔡中華等［20］對(duì)幼鯉，彭士明［30］對(duì)黑鯛的研究中均發(fā)現(xiàn)，飼料中添加維生素E均可顯著降低組織中MDA含量。但 Kaewsrithong等［9］在對(duì)香魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中較多的維生素E反而會(huì)加強(qiáng)香魚(yú)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。原因可能是維生素E與MDA間存在某種劑量效應(yīng)關(guān)系，過(guò)大劑量維生素E具有促氧化性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些維生素E在從機(jī)體分離出的低密度脂蛋白(LDL)中存在抗氧化劑性質(zhì)［31］，維生素E自由基與LDL的多不飽和脂肪酸的化學(xué)反應(yīng)是這種抗氧化性質(zhì)產(chǎn)生的原因。維生素E對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的調(diào)節(jié)作用，特別是其中具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

綜合羅非魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)與生理情況，本試驗(yàn)中維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)的最大未觀察到有害作用劑量組為250 mg/kg組，即維生素E日攝入量8.50 mg/kg，故維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)56 d的最大未觀察到有害作用劑量值為8.50 mg/(kg·d)。

4 結(jié)論

①飼料中添加50～250 mg/kg維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)具有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，但添加量達(dá)到2 500 mg/kg時(shí)，羅非魚(yú)幼魚(yú)出現(xiàn)輕微的生長(zhǎng)抑制癥狀。

②高于需求量數(shù)倍的維生素E能夠增強(qiáng)羅非魚(yú)幼魚(yú)的抗氧化酶活性。過(guò)大劑量維生素E雖然可以減輕魚(yú)體的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，但會(huì)抑制抗氧化酶活性，顯示一定的毒性效應(yīng)。

③本試驗(yàn)中維生素E對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)的最大未觀察到有害作用劑量為8.50 mg/(kg·d)。

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