佟穎,蘇冠霞,金湯,王博,楊福慶,孟潔,楊新
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;3.哈爾濱市中醫(yī)醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150008;4.黑龍江省饒河縣中醫(yī)院,黑龍江 饒河 155700)
痛風(fēng)和高尿酸血癥是多基因遺傳性疾病,血尿酸升高是痛風(fēng)發(fā)病的重要生化基礎(chǔ),經(jīng)我課題組研究進(jìn)一步證實(shí),嘌呤代謝過程中關(guān)鍵酶缺陷是引起尿酸生成增多的主要原因,HPRT基因缺陷可導(dǎo)致其活性降低,可使鳥嘌呤核苷酸和次黃嘌呤核苷酸減少,最終導(dǎo)致其終末產(chǎn)物尿酸增加。
1.1 一般資料
本研究所有病例均為2007~2011年間黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕科門診診斷為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患者,共78例。其中男性71例,女性7例。正常人外周血樣品,取自本院5個(gè)健康自愿者。模型組為78例痛風(fēng)患者治療前的血樣。按隨機(jī)的原則分為治療組(痹寧膠囊組)和對(duì)照組(秋水仙堿組),兩組病人的一般情況經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,無顯著性差異(P>0.05),具有可比性。
1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)
1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照第7版的《內(nèi)科》[1]“高尿酸血癥與痛風(fēng)”中的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及孟昭亨編著的《急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)》[2]。
1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)前期研究結(jié)論及痹寧湯的組方原則,依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[3]中《痛風(fēng)》的中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn),對(duì)納入病例進(jìn)行濕濁瘀熱證的中醫(yī)證候辨證診斷。
2.1 治療藥物 痹寧膠囊主要成分:金錢草15g,山慈菇20g,車前子12g,威靈仙15g,秦艽15g,萆薢15g,土茯苓15g,連翹10g,川芎 12g,忍冬藤 20g,牛膝10g等,規(guī)格為0.5g/袋,每袋含生藥 0.3mg,每日 3 次,每次4粒,口服。
2.2 對(duì)照藥物 秋水仙堿片(西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司)每日2次,每次2片,飯后服。兩組患者均連續(xù)服藥,7天為1個(gè)療程,2個(gè)療程后統(tǒng)計(jì)療效,服藥期間禁服高嘌呤飲食、辛辣刺激物、飲酒等。
2.3 主要試劑 PCR引物β-actin長(zhǎng)度432bp,HPRT長(zhǎng)度653bp;Trizol RNAIsolation;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒;TaqDNA聚合酶;紫外可見凝膠檢測(cè)成像系統(tǒng)。
2.4 觀測(cè)指標(biāo) 血清HPRT mRNA水平。
2.5 實(shí)驗(yàn)步驟 RT-PCR法檢測(cè)痛風(fēng)患者血清HPRT mRNA表達(dá),計(jì)算提取總RNA量,進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄雙鏈cDNA,運(yùn)用DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增cDNA,擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中,電泳分離后在紫外燈下觀察并拍照,用VILBER LOURMAT型成像系統(tǒng)進(jìn)行分析,分別測(cè)量HPRT mRNA、β-actin電泳條帶的光密度和面積,以HPRT/β-actin比值代表HPRT mRNA表達(dá)水平。
2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
3.1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清HPRT mRNA電泳條帶
如圖1、2 結(jié)果顯示,在瓊脂糖電泳凝膠上紫外燈下觀察均可見653bp片段,但各組電泳條帶亮度有明顯差異。各組β-actin電泳條帶亮度一致,擴(kuò)增片段均為432bp。
圖1 β-actin mRNA RT-PCR電泳產(chǎn)物
圖2 HPRT mRNA RT-PCR電泳產(chǎn)物
3.2 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清HPRT的mRNA電泳產(chǎn)物灰度掃描值變化 見表1。
表1 HPRT mRNA電泳產(chǎn)物灰度值變化的比較(±s)
表1 HPRT mRNA電泳產(chǎn)物灰度值變化的比較(±s)
注:與模型組相比,★P <0.01;治療組與對(duì)照組比較,▲P <0.01。
正常組 5 0.8213 ±0.0085★模型組 78 0.1826 ±0.0055治療組 42 0.8057 ±0.0422★▲陽性對(duì)照組 36 0.5835 ±0.0343★
以上結(jié)果表明,與正常組相比,兩組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者治療前HPRT mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01);治療后兩組HPRT mRNA表達(dá)比治療前明顯升高(P<0.01);治療組與對(duì)照組相比,血清HPRT mRNA表達(dá)升高的更明顯(P<0.01)。
痛風(fēng)和高尿酸血癥是多基因遺傳缺陷性疾病?,F(xiàn)已證實(shí),嘌呤代謝過程中關(guān)鍵酶缺陷是引起尿酸生成增多的主要原因,其中磷酸核糖焦磷酸合成酶、磷酸核糖焦磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷屬于x伴性遺傳,黃嘌呤氧化酶活性增加可能為多基因遺傳,我們主要研究尿酸生成增多的相關(guān)基因。HPRT是嘌呤代謝補(bǔ)救合成途徑中的關(guān)鍵酶,已成為基因突變機(jī)制和修復(fù)機(jī)制理想的研究靶點(diǎn)[4],HPRT基因缺陷導(dǎo)致其活性降低可使鳥嘌呤和次黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤核苷酸和次黃嘌呤核苷酸減少,兩種嘌呤不能被再利用合成核酸而被清除,最終導(dǎo)致其終末產(chǎn)物尿酸增加。本研究從分子水平進(jìn)一步闡明HPRT基因缺陷可導(dǎo)致尿酸合成增加,而痹寧膠囊能明顯改善患者的基因缺陷,減少血尿酸形成,為痛風(fēng)的早期防治和開發(fā)新的藥物作用靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
痛風(fēng)以脾腎失調(diào),臟腑蘊(yùn)熱為本,以濕熱痰瘀濁毒為標(biāo)[5]?;颊叻A賦多為濕熱之體,再加以嗜酒,喜啖膏粱厚味,致臟腑功能失調(diào),升清降濁無權(quán),積聚之濕熱壅滯于血脈中,郁于骨節(jié),又兼因外感風(fēng)邪侵襲經(jīng)絡(luò),致氣血運(yùn)行不暢,痰濕客于筋骨、肌肉之間[6]。方中金錢草、車前子為君藥,有利水通淋,除濕解毒消腫之功,其性甘淡滲利,咸能軟堅(jiān),微寒清熱,通利三焦,長(zhǎng)于祛濕,治痹證濕甚者尤佳。威靈仙為臣藥,其辛溫而散寒,性猛善走,通行十二經(jīng)脈,既能祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò),又能止痹痛,同時(shí)配秦艽、土茯苓、萆薢、羌活共為臣藥祛風(fēng)濕,清濕熱,止痹痛,清虛熱?,F(xiàn)代藥理研究證實(shí),威靈仙煎劑有一定免疫抑制作用[7],山慈菇既有秋水仙堿樣的作用,還有明顯抑制血管生成活性和滑膜組織的作用,可用于消除關(guān)節(jié)的炎癥[8-9]。車前子能抑制尿酸合成,金錢草有與雙氫克尿噻相似的增強(qiáng)輸尿管蠕動(dòng)和增加尿流量的效應(yīng),且兩種效應(yīng)呈平行關(guān)系,萆薢、秦艽、土茯苓有利尿作用,從而最終達(dá)到降低血尿酸,治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[10-11]。
研究結(jié)果表明,基因點(diǎn)突變、插入缺失多態(tài)等均可導(dǎo)致該酶活性下降,尿酸合成增加,臨床表現(xiàn)為L(zhǎng)asch-Nylan綜合征或僅表現(xiàn)為高尿酸血癥或痛風(fēng)。而痹寧膠囊可以顯著改善HPRT mRNA表達(dá),使患者血尿酸生成減少,從源頭上進(jìn)行根本性的治療。
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