佟穎，蘇冠霞，金湯，王博，楊福慶，孟潔，楊新

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3．哈爾濱市中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150008;4．黑龍江省饒河縣中醫(yī)院，黑龍江 饒河 155700)

痛風(fēng)和高尿酸血癥是多基因遺傳性疾病，血尿酸升高是痛風(fēng)發(fā)病的重要生化基礎(chǔ)，經(jīng)我課題組研究進一步證實，嘌呤代謝過程中關(guān)鍵酶缺陷是引起尿酸生成增多的主要原因，HPRT基因缺陷可導(dǎo)致其活性降低，可使鳥嘌呤核苷酸和次黃嘌呤核苷酸減少，最終導(dǎo)致其終末產(chǎn)物尿酸增加。

1 臨床資料

1．1 一般資料

本研究所有病例均為2007～2011年間黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕科門診診斷為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患者，共78例。其中男性71例，女性7例。正常人外周血樣品，取自本院5個健康自愿者。模型組為78例痛風(fēng)患者治療前的血樣。按隨機的原則分為治療組(痹寧膠囊組)和對照組(秋水仙堿組)，兩組病人的一般情況經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，無顯著性差異(P＞0.05)，具有可比性。

1．2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1．2．1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照第7版的《內(nèi)科》［1］“高尿酸血癥與痛風(fēng)”中的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及孟昭亨編著的《急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)》［2］。

1．2．2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)前期研究結(jié)論及痹寧湯的組方原則，依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》［3］中《痛風(fēng)》的中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)，對納入病例進行濕濁瘀熱證的中醫(yī)證候辨證診斷。

2 方法

2．1 治療藥物 痹寧膠囊主要成分:金錢草15g，山慈菇20g，車前子12g，威靈仙15g，秦艽15g，萆薢15g，土茯苓15g，連翹10g，川芎 12g，忍冬藤 20g，牛膝10g等，規(guī)格為0．5g/袋，每袋含生藥 0．3mg，每日 3 次，每次4粒，口服。

2．2 對照藥物 秋水仙堿片(西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司)每日2次，每次2片，飯后服。兩組患者均連續(xù)服藥，7天為1個療程，2個療程后統(tǒng)計療效，服藥期間禁服高嘌呤飲食、辛辣刺激物、飲酒等。

2．3 主要試劑 PCR引物β－actin長度432bp，HPRT長度653bp;Trizol RNAIsolation;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒;TaqDNA聚合酶;紫外可見凝膠檢測成像系統(tǒng)。

2．4 觀測指標(biāo) 血清HPRT mRNA水平。

2．5 實驗步驟 RT－PCR法檢測痛風(fēng)患者血清HPRT mRNA表達，計算提取總RNA量，進行RNA逆轉(zhuǎn)錄雙鏈cDNA，運用DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增cDNA，擴增產(chǎn)物在1．5%瓊脂糖凝膠電泳中，電泳分離后在紫外燈下觀察并拍照，用VILBER LOURMAT型成像系統(tǒng)進行分析，分別測量HPRT mRNA、β－actin電泳條帶的光密度和面積，以HPRT/β－actin比值代表HPRT mRNA表達水平。

2．6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3．1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清HPRT mRNA電泳條帶

如圖1、2 結(jié)果顯示，在瓊脂糖電泳凝膠上紫外燈下觀察均可見653bp片段，但各組電泳條帶亮度有明顯差異。各組β－actin電泳條帶亮度一致，擴增片段均為432bp。

圖1 β－actin mRNA RT－PCR電泳產(chǎn)物

圖2 HPRT mRNA RT－PCR電泳產(chǎn)物

3．2 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血清HPRT的mRNA電泳產(chǎn)物灰度掃描值變化 見表1。

表1 HPRT mRNA電泳產(chǎn)物灰度值變化的比較(±s)

表1 HPRT mRNA電泳產(chǎn)物灰度值變化的比較(±s)

注:與模型組相比，★P ＜0．01;治療組與對照組比較，▲P ＜0．01。

正常組 5 0．8213 ±0．0085★模型組 78 0．1826 ±0．0055治療組 42 0．8057 ±0．0422★▲陽性對照組 36 0．5835 ±0．0343★

以上結(jié)果表明，與正常組相比，兩組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者治療前HPRT mRNA表達明顯下降(P＜0.01);治療后兩組HPRT mRNA表達比治療前明顯升高(P＜0．01);治療組與對照組相比，血清HPRT mRNA表達升高的更明顯(P＜0．01)。

4 討論

痛風(fēng)和高尿酸血癥是多基因遺傳缺陷性疾病。現(xiàn)已證實，嘌呤代謝過程中關(guān)鍵酶缺陷是引起尿酸生成增多的主要原因，其中磷酸核糖焦磷酸合成酶、磷酸核糖焦磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷屬于x伴性遺傳，黃嘌呤氧化酶活性增加可能為多基因遺傳，我們主要研究尿酸生成增多的相關(guān)基因。HPRT是嘌呤代謝補救合成途徑中的關(guān)鍵酶，已成為基因突變機制和修復(fù)機制理想的研究靶點［4］，HPRT基因缺陷導(dǎo)致其活性降低可使鳥嘌呤和次黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤核苷酸和次黃嘌呤核苷酸減少，兩種嘌呤不能被再利用合成核酸而被清除，最終導(dǎo)致其終末產(chǎn)物尿酸增加。本研究從分子水平進一步闡明HPRT基因缺陷可導(dǎo)致尿酸合成增加，而痹寧膠囊能明顯改善患者的基因缺陷，減少血尿酸形成，為痛風(fēng)的早期防治和開發(fā)新的藥物作用靶點提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

痛風(fēng)以脾腎失調(diào)，臟腑蘊熱為本，以濕熱痰瘀濁毒為標(biāo)［5］?；颊叻A賦多為濕熱之體，再加以嗜酒，喜啖膏粱厚味，致臟腑功能失調(diào)，升清降濁無權(quán)，積聚之濕熱壅滯于血脈中，郁于骨節(jié)，又兼因外感風(fēng)邪侵襲經(jīng)絡(luò)，致氣血運行不暢，痰濕客于筋骨、肌肉之間［6］。方中金錢草、車前子為君藥，有利水通淋，除濕解毒消腫之功，其性甘淡滲利，咸能軟堅，微寒清熱，通利三焦，長于祛濕，治痹證濕甚者尤佳。威靈仙為臣藥，其辛溫而散寒，性猛善走，通行十二經(jīng)脈，既能祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)，又能止痹痛，同時配秦艽、土茯苓、萆薢、羌活共為臣藥祛風(fēng)濕，清濕熱，止痹痛，清虛熱?，F(xiàn)代藥理研究證實，威靈仙煎劑有一定免疫抑制作用［7］，山慈菇既有秋水仙堿樣的作用，還有明顯抑制血管生成活性和滑膜組織的作用，可用于消除關(guān)節(jié)的炎癥［8－9］。車前子能抑制尿酸合成，金錢草有與雙氫克尿噻相似的增強輸尿管蠕動和增加尿流量的效應(yīng)，且兩種效應(yīng)呈平行關(guān)系，萆薢、秦艽、土茯苓有利尿作用，從而最終達到降低血尿酸，治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎［10－11］。

研究結(jié)果表明，基因點突變、插入缺失多態(tài)等均可導(dǎo)致該酶活性下降，尿酸合成增加，臨床表現(xiàn)為Lasch－Nylan綜合征或僅表現(xiàn)為高尿酸血癥或痛風(fēng)。而痹寧膠囊可以顯著改善HPRT mRNA表達，使患者血尿酸生成減少，從源頭上進行根本性的治療。

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