張躍環(huán)，王昭萍，閆喜武，霍忠明，姚 托，蘇家齊

(1.中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071;2.海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301 3.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，大連 116023)

配子兼容是指物種間或者物種內(nèi)的雌雄個(gè)體之間精卵能夠識(shí)別，完成受精作用，從而繁育子代。對(duì)于同一物種而言，絕大部分情況下雌雄配子都具有很好的兼容性;但對(duì)于種間雜交來講，會(huì)出現(xiàn)配子不兼容或者不對(duì)稱兼容現(xiàn)象［1］。這種配子不兼容往往會(huì)導(dǎo)致種間產(chǎn)生生殖隔離。生殖隔離是指由于各方面的原因，使親緣關(guān)系接近的物種之間在自然條件下不交配，即使能交配也不能產(chǎn)生后代或不能產(chǎn)生可育性后代的隔離機(jī)制。生殖隔離如果發(fā)生在受精以前，就稱為受精前隔離，包括地理隔離、生態(tài)隔離、季節(jié)隔離、生理隔離、形態(tài)隔離和行為隔離等;若隔離發(fā)生在受精以后，就稱為受精后的生殖隔離，包括雜種不活、雜種不育和雜種衰敗等［2］。在自然界中，種間配子不兼容是保證物種單一性的一種有效手段。

對(duì)于海洋無脊椎動(dòng)物而言，生活在重疊區(qū)域內(nèi)的近緣種的生殖隔離大部分是由于種間配子不兼容引發(fā)的［3］。學(xué)者們先后從受精水平上研究了長(zhǎng)牡蠣Crassostrea gigas×熊本牡蠣C.sikamea［4］、長(zhǎng)牡蠣C.gigas×美洲牡蠣 C.virginica［5］、紫貽貝 Mytilus edulis× 蓋勒貽貝 M.trossulus［1］、3 種熱帶海膽 Echinometra lucunter×E.viridis×E.lucunter［6］的種間配子不兼容格局，從而進(jìn)一步解釋生殖隔離機(jī)制。香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)是暖溫性近岸生長(zhǎng)的一個(gè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的種類，喜好高溫低鹽環(huán)境，是我國(guó)南方養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)種，分布長(zhǎng)江以南，核心區(qū)為福建、廣東、廣西，年產(chǎn)量在100多萬噸［7］。而長(zhǎng)牡蠣(C.gigas)分布在我國(guó)長(zhǎng)江以北，喜好低溫高鹽環(huán)境，為世界性養(yǎng)殖品種，主要集中在我國(guó)遼寧、山東等地，年產(chǎn)量近100萬噸。由于生長(zhǎng)速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、肉味鮮美，深受廣大消費(fèi)者青睞［8］。作為我國(guó)最重要的兩種牡蠣經(jīng)濟(jì)種，從分布范圍上，他們之間無生活重疊區(qū);從其生活環(huán)境上看，它們生態(tài)類型截然相反;從其遺傳進(jìn)化角度上，這兩個(gè)種類在巨蠣屬牡蠣中遺傳距離較遠(yuǎn)，而且種間分化較早，大約在2880萬年前發(fā)生了種間分歧，并成功進(jìn)化為兩個(gè)物種［9］。為了探討這兩個(gè)物種間的配子兼容性問題，本文從外界因子(溫度、鹽度)及內(nèi)在因子(精子濃度、個(gè)體差異水平)水平上檢測(cè)了它們對(duì)其配子兼容性的影響，并且求算了F50臨界值，旨在為這兩個(gè)物種的種間雜交及其遺傳進(jìn)化奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2010年5月下旬，采集2齡香港巨牡蠣Crassostrea hongkongensis(廣東深圳)和1齡長(zhǎng)牡蠣C.gigas(遼寧大連)樣本，置于大連莊河海量水產(chǎn)食品有限公司生態(tài)蝦池進(jìn)行生態(tài)促熟。由于2齡香港巨牡蠣及1齡長(zhǎng)牡蠣具有較好的繁殖能力，故本實(shí)驗(yàn)選用該年齡段親本作為實(shí)驗(yàn)樣品。促熟期間，水溫22.5—29.3℃，鹽度24—30，pH值7.86—8.92;生態(tài)蝦池中富含大量的有機(jī)碎屑及單胞藻類，可以滿足親本對(duì)天然餌料的需求，故親本性腺可以正常發(fā)育。至7月初，兩種牡蠣的性腺已經(jīng)完全成熟。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了查明最主要外界環(huán)境因子溫度、鹽度對(duì)兩種牡蠣種間配子不兼容格局影響?？紤]到香港巨牡蠣繁殖季節(jié)水溫一般不高于30℃，鹽度大多不低于12［7］;而長(zhǎng)牡蠣繁殖季節(jié)水溫基本均在20℃以上，鹽度不超過30［8］。本文分別設(shè)計(jì) 5 個(gè)溫度(16、20、24、28、32 ℃)梯度及 5 個(gè)鹽度梯度(10、15、20、25、30)，每個(gè)梯度重復(fù)實(shí)驗(yàn)36次，每次均為單對(duì)雜交實(shí)驗(yàn)(表1)。采用解剖方法獲取牡蠣精卵，選取配子優(yōu)良的個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在100 mL燒杯中進(jìn)行，卵子密度控制在40—50個(gè)/mL，精子濃度控制在120 000—150 000個(gè)/mL。溫度實(shí)驗(yàn)中，利用恒溫箱來控制溫度，鹽度控制在25;鹽度實(shí)驗(yàn)中，利用自然海水(鹽度30)作為母液，加經(jīng)過24 h曝氣的淡水來配置其它鹽度梯度，溫度控制在32℃。

海洋無脊椎動(dòng)物的配子兼容性分析中，精子濃度至關(guān)重要，因?yàn)樗桥渥蛹嫒菪灾械膬?nèi)在因素。通常情況下，較低的濃度會(huì)導(dǎo)致種間配子兼容性較差，過高的濃度雖然會(huì)得到較高受精率，但經(jīng)常會(huì)造成孵化中畸形率過高。參照 Banks［4］，Lyu 和 Allen［5］對(duì)牡蠣配子不兼容格局分析，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了 100、101、102、103、104個(gè)/μL 5個(gè)精子濃度梯度，其中，精子通過血球計(jì)數(shù)板來測(cè)定密度，實(shí)驗(yàn)中卵子密度控制在40—50個(gè)/mL。在溫度32℃、鹽度25的條件下，采用100 mL燒杯作為實(shí)驗(yàn)容器，開展36次單對(duì)雜交實(shí)驗(yàn)(表1)。為了進(jìn)一步探討牡蠣個(gè)體間差異對(duì)配子兼容性的影響，在溫度32℃、鹽度25、精子濃度104個(gè)/μL的條件下，采用建立單對(duì)雜交家系(表1)的方法測(cè)定個(gè)體間差異。其中，受精成功的標(biāo)志為受精膜舉起，釋放出兩個(gè)極體，之后進(jìn)入2—4細(xì)胞卵裂狀態(tài);受精率為發(fā)生卵裂受精卵數(shù)量與總卵量的百分率。

表1 單對(duì)雜交家系設(shè)計(jì)Table 1 The design of diallel cross by one female to one male method

1.3 F50臨界值計(jì)算

為了探討溫度、鹽度、精子濃度及個(gè)體差異與配子兼容性之間的關(guān)系。參照貽貝［1］及海膽［6，10］配子不兼容分析方法，制定了牡蠣種間配子F50臨界值，是指雌雄配子發(fā)生50%受精率時(shí)的臨界溫度、鹽度、精子濃度及其單對(duì)雜交的中個(gè)體差異比例。以往學(xué)者采用了一種比較繁瑣的非線性動(dòng)態(tài)模型來計(jì)算配子兼容性，該模型對(duì)于海膽比較實(shí)用，但是對(duì)于貽貝等貝類不太合適。因此，本實(shí)驗(yàn)尚未采用以上作者方法，而是參照菲律賓蛤仔［11］及青蛤［12］幼蟲饑餓中的不可逆點(diǎn)求算方法，采用如下二次函數(shù)公式來計(jì)算F50臨界值:

式中，y表示受精率(%)，x表示溫度(℃)、鹽度、精子濃度的對(duì)數(shù)(log［個(gè)/μL］)、個(gè)體間雜交次數(shù)，a為二次項(xiàng)系數(shù)，b為一次項(xiàng)系數(shù)，c為常數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

為了保持方差齊性，所有受精率均轉(zhuǎn)化為反正弦函數(shù)Asin，精子濃度轉(zhuǎn)化為log10。利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，不同實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析方法(Turkey HSD)，差異顯著性設(shè)置為 P ＜0.05，極顯著設(shè)置為 P ＜0.01，Excel作圖。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)配子兼容性的影響

如圖1所示，對(duì)長(zhǎng)牡蠣GG而言，受精率隨著溫度的升高先增大而后趨于平穩(wěn);至于香港巨牡蠣HH及其雜交組HG，二者受精率均隨著溫度的升高而增大;雜交組GH受精率為0，也就說在香港巨牡蠣與長(zhǎng)牡蠣的雜交過過程中，存在著明顯的單向受精現(xiàn)象。在16℃時(shí)，雜交組HG受精率(8.28%)高于香港巨牡蠣(1.72%)，且都顯著小于長(zhǎng)牡蠣(28.28%)(P＜0.05)(表2)。這主要是由于長(zhǎng)牡蠣的精子在較低的溫度下具有一定活力，而香港巨牡蠣精子活力較差造成的。20℃時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的受精率均得到了明顯提高。GG的受精率高達(dá)92.45%，顯著高于 HH(48.78%)與 HG(38.83%)(P ＜0.05)(表2)。24—32℃期間，GG 受精率最高接近100%，HH與HG的受精率具有顯著提高，且HH的受精率一直高于HG(圖1)。32℃時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組受精率均達(dá)到最高水平，其中，GG受精率為99.38%，HH為94.58%，HG為86.59%(圖1)。經(jīng)過二次函數(shù)模型推算，HG的溫度F50臨界值介于兩親本GG及HH之間，GG，HG及HH的F50臨界值分別為17.12℃，20.29 ℃，21.45 ℃(表 3)。

圖1 溫度對(duì)配子兼容性的影響Fig.1 Effect of temperature on gamete compatibility

圖2 鹽度對(duì)配子兼容性的影響Fig.2 Effect of salinity on gamete compatibility

2.2 鹽度對(duì)配子兼容性的影響

GG受精率隨著鹽度的升高而增大，HH及HG 的受精隨著鹽度升高先增大后減;HH最高受精率出現(xiàn)在鹽度18左右，而HG最高受精率出現(xiàn)在鹽度25(圖2)，GH尚未發(fā)生受精，受精率為0。在鹽度10時(shí)，HH受精率最大為46.84%，HG居中為27.30%，GG最小為10.27%，且三者之間存在顯著差異(P＜0.05)(表4)。在鹽度15時(shí)，HH受精率仍然最高，但此時(shí)GG受精率大于HG，且三者之間差異顯著(P＜0.05)(表4)。鹽度20時(shí)，GG與HH受精率大小相似，均顯著大于HG(P＜0.05)(表4)。鹽度25－30期間，GG受精率最高，顯著大于HH和HG(P＜0.05)(表4)。經(jīng)過二次函數(shù)模型推算，HG的鹽度F50臨界值為14.70，大于GG的13.12。在圖2中，雖然可以看到HH的F50臨界值在鹽度10.20左右，但是經(jīng)過二次函數(shù)模擬，得不到該臨界值，因?yàn)槟Ｐ椭械膟軸截距已經(jīng)大于50%(表3)。

表2 溫度對(duì)配子兼容性影響的方差分析Table 2 Analysis of variance for the effect of temperature on gamete compatibility

表3 不同溫度、鹽度、精子濃度及個(gè)體差異下的F50臨界值Table 3 The critical value of F50under different temperature，salinity，sperm concentration and individual variation

表4 鹽度對(duì)配子兼容性影響的方差分析Table 4 Analysis of variance for the effect of salinity on gamete compatibility

表5為溫度，鹽度兩種外界環(huán)境因子對(duì)配子兼容性的交互作用應(yīng)。對(duì)于GG來講，溫度是影響其配子兼容性的主要因子，次要因子為鹽度。對(duì)于HH而言，鹽度是影響其配子兼容性的主要因子，其次為溫度。至于HG，溫度及鹽度的交互作用是影響配子兼容性的主要因子，其次為溫度，最后是鹽度。

表5 溫度及鹽度交互作用對(duì)配子兼容性的影響Table 5 Analyses of variance showing the interaction effect between temperature and salinity for gamete compatibility

2.3 S精子濃度對(duì)配子兼容性的影響

GG受精率幾乎不受精子濃度的影響，其受精率在不同精子濃度下均接近100%;HH和HG受精率隨著精子濃度增加先快速增加后緩慢增長(zhǎng)(圖3)，GH受精率為0。在精子100個(gè)/μL濃度時(shí)，GG受精率為97.32%，HH為67.74%，而HG僅為37.98%，且彼此間差異顯著(P＜0.05)(圖3)(表6)。由此可以看出在較低精子濃度下，配子兼容性存在著較大的種內(nèi)及其種間差異。在精子濃度101—104個(gè)/μL過渡過程中，HH及HG受精率隨著精子濃度緩慢增長(zhǎng)，均顯著小于GG受精水平(P＜0.05)(圖3)(表6)。在精子濃度104個(gè)/μL時(shí)，GG、HH 及HG 受精率分別為99.47%、90.91%、85.52%(圖3)。經(jīng)過二次函數(shù)模型推算，HG 的精子濃度F50臨界值為2.40個(gè)/μL。由于GG及HH受精率均在50%以上，故二者不存在F50臨界值(表3)。

表6 精子濃度對(duì)配子兼容性影響的方差分析Table 6 Analysis of variance for the effect of sperm concentration on gamete compatibility

2.4 個(gè)體間配子兼容性差異分析

如圖4所示，按照上面最佳的優(yōu)化條件，在240次雜交實(shí)驗(yàn)中，GG受精水平最高，平均為96.83%;其次為HH，平均水平為70.98%;受精率最低的是HG，為58.70%，GH受精率仍為0。從HG受精水平上看，實(shí)際超過F50臨界值的雜交實(shí)驗(yàn)次數(shù)為164次，但如果按照模擬曲線看為149次，二者較為接近，大約有2/3的比例可以突破種間配子兼容性F50臨界值(表3)。至于HH，實(shí)際上一共有216次超過了F50臨界值，但理論上只有197次，二者仍比較接近，說明動(dòng)態(tài)函數(shù)曲線具有較好的擬合性(表3)。為了進(jìn)一步查明個(gè)體間差異對(duì)其配子兼容性的影響，作者按照受精水平不同劃分了10個(gè)受精級(jí)別，并計(jì)算了各級(jí)別受精水平的分布頻率。其中，HG在級(jí)別1—10均有分布，受精率從3.60%至97.60%分布范圍最廣，說明種間配子識(shí)別存在非常大的個(gè)體差異;但平均水平最低，說明種間配子存在一定程度的生殖隔離障礙(圖4)(表7)。HH分布在2—10級(jí)別受精水平上，受精率從12.0%至98.5%，說明香港巨牡蠣本身就存在較大的個(gè)體差異(圖4)(表7)。而GG受精水平僅僅分布在9—10級(jí)別上，三者中受精水平最高，且受精率相對(duì)比較一致，也說明長(zhǎng)牡蠣種內(nèi)配子兼容性較好(圖4)(表7)。

圖3 精子濃度對(duì)配子兼容性的影響Fig.3 Effect of sperm concentration on gamete compatibility

圖4 配子兼容性的個(gè)體差異比較Fig.4 Comparison of individual variation on gamete compatibility

表7 不同受精水平級(jí)別下各實(shí)驗(yàn)組分布頻率Table 7 Distribution frequency of each experimental group under different sperm concentrations this should be given in the form of table

3 討論

3.1 單向受精

香港巨牡蠣的卵子可以與長(zhǎng)牡蠣的精子受精，而長(zhǎng)牡蠣的卵子不能夠與香港巨牡蠣的精子受精，也就是說，在香港巨牡蠣與長(zhǎng)牡蠣雜交中，存在著明顯的不對(duì)稱受精現(xiàn)象。這種單向受精不受溫度、鹽度等外界環(huán)境因子和內(nèi)在的精子濃度及個(gè)體差異影響，已有研究表明:在精卵識(shí)別的過程中，精子結(jié)合素蛋白是決定能否受精的一個(gè)關(guān)鍵基因家族，這種基因家族進(jìn)化速度較快，往往導(dǎo)致了不對(duì)稱受精現(xiàn)象的發(fā)生［13-14］。這種單向受精機(jī)制引發(fā)了不對(duì)稱的受精前生殖隔離機(jī)制，使得種間配子兼容性效應(yīng)減半。在以往的牡蠣配子兼容性分析中，單向受精比較常見，學(xué)者們先后發(fā)現(xiàn)了熊本牡蠣C.sikamea(♀)×長(zhǎng)牡蠣C.gigas(♂)［15］、近江牡蠣C.rivularis(♀)×美洲牡蠣 C.virginica(♂)［16］，熊本牡蠣 C.sikamea(♀)×近江牡蠣 C.ariakensis(♂)［17］具有單向受精現(xiàn)象。香港巨牡蠣卵子可以與長(zhǎng)牡蠣精子受精說明，雌性香港巨牡蠣與雄性長(zhǎng)牡蠣遺傳分化具有一定的相似性;而香港巨牡蠣精子不能與長(zhǎng)牡蠣卵子受精說明，香港巨牡蠣雄性與長(zhǎng)牡蠣雌性之間存在著一定程度的遺傳歧化，這可能是性別非趨同進(jìn)化的結(jié)果［17］。

3.2 外界因子

外界環(huán)境因子溫度、鹽度對(duì)香港巨牡蠣與長(zhǎng)牡蠣配子兼容性有較大影響。這主要是由于香港巨牡蠣與長(zhǎng)牡蠣的生態(tài)類型截然相反，一種是喜好高溫低鹽，另一種是喜好低溫高鹽［7］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，溫度是影響長(zhǎng)牡蠣配子兼容性的最主要因子，而鹽度是影響香港巨牡蠣的主要因子，種間配子兼容性主要受到溫度、鹽度二者交互作用影響。以往學(xué)者們的研究對(duì)象均是針對(duì)分布在相同生活重疊區(qū)的近緣種，故他們一般不做溫度、鹽度這樣的外在因子影響分析，而是完全模擬生活區(qū)的環(huán)境來完成實(shí)驗(yàn)，由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)象生活生態(tài)型不同，故有必要對(duì)其進(jìn)行探討、摸索，以便獲取更好的種間配子兼容性，有利于以后的種間雜交研究［1，4，6，10］。溫度的F50臨界值從長(zhǎng)牡蠣、雜交子、香港巨牡蠣逐漸升高，說明長(zhǎng)牡蠣耐低溫能力要強(qiáng)一些，香港巨牡蠣需更要高溫環(huán)境，雜交子恰恰居于二者中間;鹽度的F50臨界值長(zhǎng)牡蠣最低，說明長(zhǎng)牡蠣對(duì)鹽度具有一定的耐受能力;雜交子較大，表明雜交時(shí)應(yīng)該注意鹽度控制，以獲取更好的配子兼容性。

3.3 內(nèi)在因子

通常情況下，精子濃度對(duì)配子兼容性有一定影響。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，在遠(yuǎn)緣雜交中，提高精子濃度有利于提高種間受精率［17-20］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著精子濃度的增加，不管是種內(nèi)還是種間受精率均得到了提高，但是種間雜交組受精率一直低于種內(nèi)組，說明存在一定程度的種間配子不兼容。其中，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的精子濃度中，種間配子精子濃度的F50臨界值為2.40個(gè)/μL，而種內(nèi)自交組不存在F50臨界值，說明在較低精子濃度情況下，種間配子不兼容性更強(qiáng)一些。隨著精子濃度的增大，種間雜交組受精率一直低于香港巨牡蠣自交組，但是他們之間受精相對(duì)比較接近，說明種間配子兼容性具有明顯的母本效應(yīng)。

個(gè)體差異也是影響配子兼容性的一個(gè)重要因素［1-2，4，6］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到，種間配子兼容性存在著較大的個(gè)體差異，其受精率分布范圍最廣，從3.60%至97.60%。在240次單對(duì)單雙列雜交實(shí)驗(yàn)中，有37.92%比例受精率不足50%，62.08%比例受精率超過50%，說明種間配子雖然存在著不兼容，但是不兼容性不強(qiáng)，可以經(jīng)過篩選優(yōu)良親本，獲取較高的受精率。從其平均受精水平上看，長(zhǎng)牡蠣受精率很高，且比較一致，說明其個(gè)體間差異較小;香港巨牡蠣受精率高于雜交子，但是分布范圍較廣，說明香港巨牡蠣存在著明顯的個(gè)體差異。

總之，本文發(fā)現(xiàn)溫度、鹽度、精子濃度及個(gè)體差異對(duì)配子兼容性均具有明顯的影響，其F50臨界值隨著條件不同而變化;而且香港巨牡蠣與長(zhǎng)牡蠣之間存在單向受精現(xiàn)象，這可能是由于種間性別非趨同進(jìn)化造成的;香港巨牡蠣與長(zhǎng)牡蠣存在著不對(duì)稱的受精前生殖隔離，至于受精后隔離機(jī)制有待深入研究。

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