陳 俊，唐安洲，梁 鋼，王立升，謝 貌，張 俊

(1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣西南寧 530021;2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西南寧 530001;3.廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西南寧 530021;4.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004)

苦參堿(Matrine)是一類具有多方面藥理活性的生物堿。近年來，發(fā)現(xiàn)該藥物在抑制腫瘤生長、殺傷和誘導腫瘤細胞凋亡等研究中表現(xiàn)出明顯活性［1－4］。有報道表明苦參堿對鼻咽癌也有一定的抑制作用［5－7］，能夠引起人鼻咽癌 CNE2細胞的增殖抑制和凋亡增加，并對Caspase途徑有激活作用［7］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)由苦參堿改構合成的苦參堿改構體X(14-噻吩基次亞甲基苦參堿，F(xiàn)ig 1)具有強于苦參堿體外抑制鼻咽癌細胞增殖的作用，且對人臍靜脈內皮細胞無損傷［8］，這種特性使得改構體X有望成為一種新型的抗鼻咽癌藥物。本研究旨在前期研究工作基礎上，將改構體X體外作用于人鼻咽癌細胞CNE1，觀察其對CNE1細胞超微結構的影響，并對Caspase蛋白家族中具有代表性的凋亡相關蛋白表達進行檢測，以探討其抗鼻咽癌的作用機制，為開發(fā)抗鼻咽癌的治療藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 人鼻咽癌細胞株CNE1于中南大學湘雅中心實驗室所購得，本實驗室接種保存。培養(yǎng)條件為:含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 苦參堿和苦參堿改構體X由廣西大學王立升教授提供和協(xié)助合成，單體純度＞98%;藥物用DMEM培養(yǎng)液稀釋，過濾除菌，4℃保存。順鉑(DDP)注射液，南京制藥廠有限公司;DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清，Hyclone公司;胰蛋白酶，GIBCO公司;PBS，Sigma公司;細胞裂解液，上海碧云天公司;一抗抗兔Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和HRP標記山羊抗兔IgG，Proteintech group公司;內參GAPDH，上?？党缮镉邢薰?。

1.3 儀器 CKX41倒置顯微鏡(Olympus)，－80℃超低溫冰箱(Forma)，58108高速冷凍離心機(Eppendorff)，2300型 CO2培養(yǎng)箱(Shellab)，H-7650型透射電鏡(日立)。

1.4 細胞培養(yǎng)與給藥 將CNE1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素和1×105U·L－1鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，定期觀察，用2.5 g·L－1胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA消化傳代。

將對數(shù)生長期的CNE1接種于6孔培養(yǎng)板中，接種密度為每孔3×105個，生長至80%以上融合度時，分別加入低、中、高劑量(29、58、116 μmol·L－1)的苦參堿改構體X，另設空白DEME培養(yǎng)細胞作為陰性對照組、DDP 組(6.67 μmol·L－1)及苦參堿組(7 258 μmol·L－1，為實驗測試出的苦參堿對 CNE1 48 h的IC50)。處理時間為48 h。

1.5 細胞超微結構觀察 分別收集作用CNE1細胞48 h后的苦參堿改構體X各劑量組、DDP組、苦參堿組與陰性組各1 ml，PBS洗3次，預冷的2%戊二醛4℃固定2 h以上，1%鋨酸后固定1.5 h后，酒精及丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，作0.5 μm切片，醋酸雙氧鈾及枸椽酸鉛染色，透射電鏡觀察照相。

1.6 Western blot檢測 Caspase-3，Caspase-8 和Caspase-9蛋白的表達 分別收集作用CNE1細胞48 h后的苦參堿改構體X各劑量組、DDP組、苦參堿組與陰性組，0.01 mol·L－1預冷 PBS洗細胞3次，加入含有5 μl PSMF 的 RIPA 緩沖液500 μl冰上裂解細胞30 min;然后4℃、12 000×g離心15 min;取上清，BCA試劑盒進行蛋白定量測定蛋白濃度，后與SDS-PAGE蛋白緩沖液按照比例混合，煮沸5 min，立即分裝，置 －20℃?zhèn)溆?。?5 μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜至PVDF膜，分別檢測Caspase-3，-8和-9的表達水平，GAPDH作為內參。對目的條帶灰度值進行半定量分析，取目的條帶與內參條帶灰度值比值為相對表達量。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行方差分析，LSD檢驗兩組間差異。

2 結果

2.1 透射電鏡觀察藥物對CNE1細胞超微結構的影響 透射電鏡下，陰性對照組細胞具有癌細胞的一般特征，細胞核大，核仁清晰，核邊界明顯，細胞核稍有內陷，常染色質多，異染色質少，細胞核與細胞質比值大，細胞內無退變的細胞器，細胞質基質密度均勻(Fig 2，F(xiàn));苦參堿改構體 X各劑量組作用CNE1 48 h后，細胞呈凋亡的形態(tài)，細胞皺縮，核內異染色質明顯增多，核周隙增大，細胞質內充滿大小不等空泡，凋亡小體形成，線粒體空泡變性，有電子致密顆粒沉積，細胞表面微絨毛變粗變短，數(shù)量減少甚至消失，細胞膜基本完整，高劑量較中低劑量凋亡程度更加明顯(Fig 2，A、B、C);苦參堿組細胞核固縮，染色質邊集，電子密度增加，部分線粒體增生，水腫，嵴模糊不清，出現(xiàn)大量自噬體，未見明顯凋亡小體(Fig 2，D);DDP組細胞大片壞死，部分凋亡指征，細胞結構溶解 (Fig 2，E)。

2.2 Western blot檢測 Caspase-3，-8和-9蛋白表達的結果 苦參堿改構體X作用CNE1細胞48 h后，各劑量組細胞內Caspase-3，-8，-9的含量均有不同程度升高，具一定的劑量依賴性;Fig 3顯示，與對照組相比，改構體X不同劑量組及DDP組處理后的Caspase-3明顯增加，苦參堿組的Caspase-3明顯增加;對于Caspase-8，低劑量改構體X與對照組差異無顯著性，其他處理組均與對照組差異有顯著性(Fig 4);高劑量改構體X組的Caspase-9表達增加量最高，各處理組均與對照組差異有顯著性(Fig 5)。Fig 6顯示 Caspase-3、Caspase-8與 Caspase-9 3種蛋白在不同處理下的表達差異。

Fig 4 Effect of derivant X of the matrine on the expression of Caspase-8(±s，n=3)

3 討論

Fig 5 Effect of derivant X of the matrine on the expression of Caspase-9(±s，n=3)

Fig 6 Expression of Caspase-3，Caspase-8 and Caspase-9 induced by derivant X of the matrine

本課題組前期研究工作中已發(fā)現(xiàn)，苦參堿經化學改構后的化合物(苦參堿改構體X)對人鼻咽癌CNE2細胞增殖有體外抑制作用，其48h的IC50值為(106.378 ±0.825)mg·L－1，低于苦參堿對CNE2 細胞的 IC50值 710 mg·L－1［8］;課題組通過MTT實驗法檢測出苦參堿和苦參堿改構體X對人鼻咽癌細胞CNE1細胞48 h的IC50分別為7 258、126 μmol·L－1(結果另文發(fā)表)，可見改構體 X 能抑制兩種人鼻咽癌細胞的生長，且作用強于其先導化合物苦參堿。

本研究設置不同劑量組改構體X處理CNE1細胞，通過透射電鏡觀察細胞超微結構發(fā)現(xiàn)，苦參堿改構X處理組的腫瘤細胞皺縮，核內異染色質明顯增多，核周隙增大，細胞質內充滿大小不等空泡，同時可找到類圓形的凋亡小體形成，其改變有別于壞死，苦參堿7 258 μmol·L－1劑量下電鏡下也出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，但未見明顯凋亡小體，提示改構體X在低于其先導化合物苦參堿的60多倍的劑量下即可誘導細胞凋亡，其誘導凋亡的作用可能是體外抑制CNE1增殖的機制之一。

Caspase-8是作為外源性凋亡途徑中的上游蛋白，可剪切激活下游凋亡執(zhí)行蛋白包括Caspase-3、-6、-7［9－10］，繼而導致細胞走向凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，改構體X高劑量組與苦參堿組作用48h后Caspase-8的表達量相當(Fig 4);與對照組相比，苦參堿組、苦參堿改構體X中、高劑量組Caspase-8的表達明顯上調，差異具有顯著性;結果提示，苦參堿和改構體X均可激活細胞凋亡的外部途徑的上游蛋白Caspase-8，有可能通過外部途徑的激活起到誘導CNE1細胞凋亡的作用。胞質蛋白凋亡活化因子-l(Apaf-l)可通過Caspase補充結構域與Caspase-9前體的原結構域結合，導致Caspase-9自身剪切活化，活化的Caspase-9進一步激活其下游Caspase-3、-6、-7，誘導細胞從內部途徑走向凋亡［11－12］。本實驗對Caspase-9表達檢測中發(fā)現(xiàn)，苦參堿改構體X低、中、高劑量組與苦參堿組可使CNE1細胞內Caspase-9表達明顯升高(P＜0.01);提示改構體X對細胞凋亡的內部途徑也有激活作用，與苦參堿表現(xiàn)出類似作用。Caspase-3是內外兩條凋亡途徑的共同執(zhí)行蛋白，許多凋亡因子最終都是作用于下游效應器Caspase-3起到促進細胞凋亡作用［13］。試驗結果顯示，苦參堿改構體X低、中、高劑量組作用后可使CNE1細胞內Caspase-3表達明顯升高(P＜0.01)，提示改構體X可能是通過激活凋亡的內外途徑中的上游蛋白Caspase-8、9，從而起到激活下游的凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3而產生促進細胞凋亡的作用。改構體X保留了先導化合物上調促凋亡蛋白表達的作用機制，而且上調表達能力更強，增多了誘導人鼻咽癌細胞凋亡途徑，對于是否可通過其他凋亡機制參與誘導調亡有待進一步研究。

［1］鄧 寧，高 華，國亞芳，等.苦參堿調控環(huán)氧化酶-2的表達及對大鼠膀胱癌抑制作用的初步研究［J］.中國藥理學通報，2012，28(3):375 －8.

［1］Deng N，Gao H，Guo Y F，et al.Preliminary study on inhibitory effect of matrine on bladder cancer via regulation of cyclooxygenase-2 expression in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(3):375－8.

［2］萬旭英，羅 明，賀 平，吳孟超.苦參堿和氧化苦參堿體外對人肝癌細胞的誘導分化作用［J］.中國藥理學通報，2009，25(7):977－9.

［2］Wan X Y，Luo M，He P，Wu M C.Effect of matrine and oxymatrine on induction of differentiation of human hepatoma carcinoma cell linein vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):977－9.

［3］鄧 惠，羅煥敏，黃 豐，等.苦參堿對U251膠質瘤細胞的增殖抑制和原癌基因表達的影響［J］.中國藥理學通報，2004，20(8):893－6.

［3］Deng H，Luo H M，Huang F，et al.Inhibition of proliferation and influence of Proto-oncogenes expression by matrine in C6 cell［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(8):893 － 6.

［4］李克雄，徐 鵬，徐為公.苦參堿類生物堿抗癌作用研究進展［J］.中國新藥雜志，2010，19(21):1948 －53.

［4］Li K X，Xu P，Xu W G.Research progress on antitumor activity of the matrine-type alkaloids［J］.Chin J New Drugs，2010，19(21):1948－53.

［5］李海英，張 力，吳式琇，等.苦參堿抗人鼻咽癌CNE2細胞的作用及其機制研究［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44(1):27 －9.

［5］Li H Y，Zhang L，Wu S X，et al.Study on the effect of matrine on human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 and its mechanism［J］.Zhejiang J Tradit Chin Med，2009，44(1):27 －9.

［6］黃宇賢，王 楊，孫 明，等.苦參堿通過誘導NKG2D配體高表達增強NK細胞對ABCG2high耐藥鼻咽癌細胞殺傷活性［J］.南方醫(yī)科大學學報，2009，29(7):1329 －32.

［6］Huang Y X，Wang Y，Sun M，et al.Matrine enhances the cytotoxic sensitivity of ABCG2high nasopharyngeal carcinoma cells to natural killer cells by inducing high expression of NKG2D receptor ligands［J］.J Southern Med Univ，2009，29(7):1329 － 32.

［7］劉岷生，任澤明，魏雪濤.Caspase-3在苦參堿誘導鼻咽癌CNE2細胞凋亡中的作用［J］.癌變 畸變 突變，2010，22(2):138－40.

［7］Liu M S，Ren Z M，Wei X T.Apoptosis and Caspase-3 changes induced by matrine in CNE2 cells［J］.Carcinog，Teratog Mutag，2010，22(2):138 －40.

［8］李靜雨，唐安洲，王立升，等.苦參堿改構體X抑制鼻咽癌細胞CNE2增殖作用的實驗研究［J］.中國醫(yī)藥導報，2011，8(17):13－5.

［8］Li J Y，Tang A Z，Wang L S，et al.Effects of modification X of the Matrine on inhibiting the growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells［J］.China Med Herald，2011，8(17):13 －5.

［9］Stepien A，Izdebska M，Grzanka A.The types of cell death［J］.Postepy Hig Med Dosw(Online)，2007，61:420－8.

［10］Joseph E K，LevineJ D.Caspase signalling in neuropathic and inflammatory pain in the rat［J］.Eur J Neurosci，2004，20(11):2896－902.

［11］Zou H，Li Y，Liu X，Wang X O.An APAF-l cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9［J］.J BioI Chem，1999，274(17):11549－56.

［12］Lee H J，Lee H J，Lee E O，et al.Mitochondria-cytochrome C-caspase-9 cascade mediates isorhamnetin-induced apoptosis［J］.Cancer Lett，2008，270(2):342 －53.

［13］Mazumder S，Plesca D，Almasan A.Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis［J］.Methods Mol Biol，2008，414:13 －21.