周妍妍，劉艷麗，董春雪，閆景東

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

老年性癡呆，又稱阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)，是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦?。?］，在發(fā)達(dá)國家，AD已成為繼心臟病、癌癥以及中風(fēng)之后導(dǎo)致人類死亡的第4位原因。該病目前沒有理想的治療藥物，給社會和家庭帶來巨大的壓力。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為五味子具有安神定志、益智強(qiáng)識之功效，經(jīng)常應(yīng)用到防治癡呆的中醫(yī)經(jīng)典方劑中(如地黃飲子、開心散、還少丹等)。五味子醇甲是五味子的重要有效成分，具有安定、鎮(zhèn)靜、抗驚活性，對大腦皮層的興奮抑制過程具有調(diào)節(jié)作用［2－3］，但對其防治 AD 的作用及機(jī)制研究較少。本研究選取APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠為研究對象，觀察五味子醇甲對小鼠腦組織神經(jīng)元變性、脫失及突觸功能等的影響，為其防治AD提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品、試劑與儀器 SYP、α-syn免疫組化試劑盒:北京博奧森生物技術(shù)有限公司。五味子醇甲:成都曼斯特生物科技有限公司。鹽酸多奈哌齊片:衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字:H20070181。病理圖像分析系統(tǒng):cimas Med 6.0，麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂SPF級APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠24只(編號:J004462，品系名稱:B6C3-Tg［APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/J］，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。同背景、同月齡的陰性小鼠8只。

2 方法

2.1 分組及給藥方法 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠隨機(jī)平均分為3組:轉(zhuǎn)基因小鼠組、鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組，每組8只;陰性小鼠8只為野生型小鼠組。鹽酸多奈哌齊組給予鹽酸多奈哌齊片(0.66 mg·kg－1·d－1)灌胃，五味子醇甲組給予五味子醇甲(10 mg·kg－1·d－1)灌胃，轉(zhuǎn)基因小鼠組給予等量生理鹽水灌胃，共4周。

2.2 取材方法 灌胃結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)測試，測試后斷頭處死，腦組織置于4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片。

2.3 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，常規(guī)蘇木精－伊紅(HE)染色，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.4 尼氏染色 石蠟切片脫蠟至水，1%甲苯胺藍(lán)染色，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.5 免疫組織化學(xué) 切片脫蠟至水;修復(fù)抗原;PBS沖洗;滴加一抗工作液(1∶300)，4℃過夜;PBS沖洗2 min×3次;滴加二抗工作液，室溫20 min;PBS沖洗2 min×3次;DAB顯色;蘇木精復(fù)染;梯度酒精脫水，二甲苯透明、樹脂封片，顯微鏡下觀察。應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行分析，200倍下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野取平均值，將陽性目標(biāo)總面積與統(tǒng)計(jì)場總面積的比值(面密度)作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 HE染色結(jié)果 野生型小鼠組可見神經(jīng)細(xì)胞分布均勻，形態(tài)正常，層次清楚，核仁清晰;轉(zhuǎn)基因小鼠組可見神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、疏松，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞萎縮，多見核深染、固縮現(xiàn)象;鹽酸多奈哌齊組病理表現(xiàn)較轉(zhuǎn)基因小鼠組有明顯改善，僅見少量神經(jīng)細(xì)胞萎縮。五味子醇甲組可見膠質(zhì)細(xì)胞增多，部分神經(jīng)元萎縮，但較轉(zhuǎn)基因小鼠組明顯改善(Fig 1)。

Fig 1 Observation of mice brain tissues by HE staining

3.2 尼氏染色 野生型小鼠組神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)中可見大量著深藍(lán)色呈斑塊狀尼氏小體;轉(zhuǎn)基因小鼠組細(xì)胞內(nèi)尼氏小體大量脫失，胞質(zhì)內(nèi)僅散在少量尼氏小體。鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組尼氏小體脫失較轉(zhuǎn)基因小鼠組明顯減少(Fig 2)。

Fig 2 Observation of mice brain tissues by nissl staining

3.3 免疫組化

3.3.1 各組小鼠腦組織中SYP的表達(dá) 轉(zhuǎn)基因小鼠組腦組織SYP表達(dá)較野生型小鼠組明顯減少(P＜0.01)，鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組較轉(zhuǎn)基因小鼠組明顯增加(P＜0.01)，差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組之間差異無顯著性(Fig 3，Tab 1)。

Fig 3 Expression of SYP in mice brain tissues examined by immunohistochemical method

3.3.2 各組小鼠腦組織中 α-syn的表達(dá) 轉(zhuǎn)基因小鼠組腦組織α-syn表達(dá)較野生型小鼠組明顯增加(P＜0.01)，鹽酸多奈哌齊組和五味子醇甲組較轉(zhuǎn)基因小鼠組明顯減少(P＜0.01)，鹽酸多奈哌齊組、五味子醇甲組之間差異無顯著性(Fig 4，Tab 1)。

Fig 4 Expression of α-syn in mice brain tissues examined by immunohistochemical method

4 討論

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠腦組織出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)元萎縮，膠質(zhì)細(xì)胞增多、尼氏小體脫失等病理變化，五味子醇甲可明顯改善其腦組織的病理改變，顯示了其神經(jīng)保護(hù)作用。SYP位于突觸囊泡上，與突觸結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系密切，其表達(dá)的水平可有效地反映突觸的狀態(tài)［4］。AD患者腦內(nèi)的神經(jīng)淀粉樣變性可導(dǎo)致突觸變性，SYP的含量降低，突觸后反應(yīng)減弱，最終導(dǎo)致突觸傳遞障礙，從而引起記憶和認(rèn)知功能下降，導(dǎo)致AD發(fā)生。在AD發(fā)病早期，突觸數(shù)量減少比神經(jīng)元喪失更顯著，還伴有突觸病理性變化［5］。所以，SYP是AD治療的標(biāo)志之一。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠組腦組織中SYP明顯降低，五味子醇甲可提高SYP的表達(dá)。αsyn是中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前膜的小分子可溶性蛋白質(zhì)，是AD患者腦內(nèi)老年斑除Aβ以外的另一重要成分，但其在AD發(fā)病中的機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為可能是α-syn的增多和病理性聚集減弱了突觸前囊泡的釋放，干擾了神經(jīng)元的軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致突觸功能障礙。另外，有研究發(fā)現(xiàn)α-syn的病理性積聚可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或死亡［6－7］。還有研究發(fā)現(xiàn)，APP轉(zhuǎn)基因擬癡呆小鼠模型腦內(nèi) α-syn明顯增加［8］，與本研究的結(jié)果相符合。本研究中APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠腦組織中α-syn明顯增高，五味子醇甲治療后α-syn較模型組明顯降低，表明降低α-syn可能是五味子醇甲防治AD的重要途徑。

Tab 1 Effect of schisandrin on expression of SYP and α-syn in mice brain tissue(±s，n=8)

Tab 1 Effect of schisandrin on expression of SYP and α-syn in mice brain tissue(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs transgenic mice group

Group SYP α-syn Wild Type group Transgenic mice group Donepezil hydrochloride group Schisandrin group 0.230 ±0.030＊＊0.163 ±0.021 0.211 ±0.030＊＊0.198 ±0.024*0.063 ±0.076＊＊0.110 ±0.011 0.080 ±0.007＊＊0.084 ±0.013＊＊

綜上可見，五味子醇甲可通過減輕APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠神經(jīng)元變性、脫失，改善突觸功能等途徑起到防治AD的作用。

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