靖 旭，孫金隆，張曉蕓，唐可欣，尹青令，吳海燕，王金紅，王濟(jì)濰，成 敏

(濰坊醫(yī)學(xué)院1.麻醉學(xué)系、2.醫(yī)學(xué)研究實驗中心，山東，濰坊 261053;3.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012)

隨著對血管內(nèi)皮生物學(xué)功能研究的不斷深入，人們已經(jīng)認(rèn)識到內(nèi)皮不僅是血管壁的襯里，而且具有復(fù)雜的表面結(jié)構(gòu)和眾多的生理功能［1］，并在心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起著重要作用。因此，內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致心血管疾病如動脈粥樣硬化等發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［2－3］。內(nèi)皮損傷表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞遷移、肥大、增殖和凋亡等，其細(xì)胞表型、形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能均發(fā)生改變。

細(xì)胞骨架是位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面的一種纖維狀蛋白基質(zhì)，這些纖維狀結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)具有網(wǎng)狀、束狀或帶狀等不同形態(tài)，包括微絲、微管和中間纖維3種組成成分。其中微絲由單體狀態(tài)(G-actin)與聚合狀態(tài)(F-actin)兩種形式的肌動蛋白組成，調(diào)控細(xì)胞諸多生理活動，例如應(yīng)力纖維的形成、細(xì)胞附著、遷移、凋亡、物質(zhì)運輸、跨膜信息傳遞以及受體的聚集［4－6］。有研究提示內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性與肌動蛋白細(xì)胞骨架息息相關(guān)，而細(xì)胞骨架的損害往往先于內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷［7］。故明晰肌動蛋白細(xì)胞骨架對內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)控可進(jìn)一步闡明動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，為其防治提供理論及實驗依據(jù)。本研究利用細(xì)胞骨架聚合劑(Jasplakinolide，JAS)促進(jìn)微絲的聚合，改變肌動蛋白細(xì)胞骨架，探討JAS對培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞生物特性的影響，以進(jìn)一步闡明細(xì)胞骨架在內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)控中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs細(xì)胞株購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。M199培養(yǎng)基(Gibco，美國);胎牛血清(Hyclone，美國);生長因子 VEGF、bFGF(invitrogen，美國);Matrigel(BD，美國);CCK8(DOJINDO，日本)，Phalloidin-FITC(ENZO，美國)，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(ROCHE，德國)，纖維粘連蛋白(Roche，德國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs于 37℃ 恒溫、含 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)液為全M199培養(yǎng)液(含 15%FBS、VEGF 10 μg·L－1及 bFGF 5 μg·L－1)。細(xì)胞用0.25%胰酶－0.02%EDTA消化傳代。

1.2.2 免疫熒光檢測細(xì)胞骨架 HUVECs胰酶消化后，接種于載玻片上。用含JAS(100 nmol·L－1)或DMSO的培養(yǎng)基分別孵育15 min、30 min、1 h及24 h后。取出載玻片，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10 min。用DAKO免疫組化筆畫標(biāo)出染色區(qū)，加入F-actin免疫熒光染料Phalloidin-FITC，DNA免疫熒光染料DAPI，37℃孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察，每張載玻片取4個視野，觀察細(xì)胞骨架的改變。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力測定 將經(jīng)JAS或DMSO作用的HUVECs消化成單細(xì)胞懸液后接種于96孔板(4 000個細(xì)胞/孔)，待細(xì)胞融合80%左右，棄去各孔培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑和培養(yǎng)基的混合液(按1∶10比例)，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60 min，利用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長的吸光度。

1.2.4 細(xì)胞粘附能力測定 用10 mg·L－1的纖維粘連蛋白預(yù)包被6孔板2 h，PBS洗3遍。HUVECs分別用JAS(100 nmol·L－1)和DMSO處理1 h后消化成單細(xì)胞懸液，分別接種于包被有纖維粘連蛋白的6孔板中。37℃，5%CO2孵育1 h后，PBS沖洗3次，每孔隨機(jī)取5個高倍鏡 (×100)視野計數(shù)貼壁細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力測定 采用改良的Boyden小室法觀察細(xì)胞遷移情況，胰酶消化經(jīng)JAS和DMSO處理的HUVECs，用含10%血清的培養(yǎng)基制成懸液計數(shù)，50 μl細(xì)胞(2×104)懸浮液注入上室，用培養(yǎng)基加滿下室。置于37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。8 h后，刮去濾膜上面的未移動細(xì)胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野(×100)，計數(shù)遷移細(xì)胞，取其平均數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞體外成血管能力測定 在預(yù)冷的96孔板中用Matrigel包被(冰上操作)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。將HUVECs(2×107L－1)接種于包被有Matrigel的96孔板中，用DMSO、JAS干預(yù)1 h，換全M199繼續(xù)孵育6 h后倒置相差顯微鏡觀察，計數(shù)成血管數(shù)目，測量微血管長度及面積。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗均重復(fù)3～4次。采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 JAS對 H UVECs細(xì)胞骨架的影響 JAS對HUVECs細(xì)胞骨架的作用具有時間依賴性:100 nmol·L－1JAS處理15 min后較 D MSO對照組，細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)增多;JAS處理1 h后細(xì)胞骨架明顯變粗，熒光強(qiáng)度增加，而作用24 h后，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞骨架聚集為團(tuán)塊狀(Fig 1)。

2.2 JAS對HUVECs增殖能力的影響 以CCK-8法測定細(xì)胞的增殖能力，與DMSO處理的對照組比較，JAS對HUVECs的增殖無明顯影響(Fig 2)。

2.3 JAS對HUVECs黏附能力的影響 在黏附實驗中，將HUVECs與纖維黏連蛋白黏附1 h后，洗去未黏附的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，相同視野范圍內(nèi)JAS處理組的HUVECs黏附細(xì)胞數(shù)(41.43±1.631)明顯多于DMSO對照組(32.86±2.098)，即JAS增加HUVECs與細(xì)胞外基質(zhì)——纖維黏連蛋白的黏附 (P＜0.05)(Fig 3)。

Fig 1 Time-dependent effects of JAS on actin distribution of HUVECs(×200)

Fig 2 Effect of JAS on cell proliferation of HUVECs

Fig 3 JAS enhances the adhesion of HUVECs

2.4 JAS對 HUVECs遷移能力的影響 Boyden小室細(xì)胞遷移實驗證實JAS增強(qiáng)HUVECs的遷移，其遷移細(xì)胞數(shù)分別為 21.09±1.648(JAS組)，16.09±1.826(DMSO組)(Fig 4)。

2.5 JAS對HUVECs體外成血管能力的影響 體外成血管實驗顯示，HUVECs具有體外成血管能力，種植于Matrigel上的細(xì)胞首尾相連成條索狀，形成血管網(wǎng)樣結(jié)構(gòu)。JAS可明顯促進(jìn)HUVECs體外管樣結(jié)構(gòu)的形成(Fig 5A)，圖像分析及統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，JAS處理組HUVECs形成的血管樣結(jié)構(gòu)其管腔長度及面積均高于 DMSO處理組(Fig 5B，C)(P＜0.05)。

Fig 4 Modified Boyden chamber analyse the effect of JAS on the migration of HUVECs

3 討論

肌動蛋白細(xì)胞骨架可以通過控制自身的聚合和解聚導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生重排，而細(xì)胞骨架的重組和分布的改變，將直接影響細(xì)胞內(nèi)信號的整合和轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期的改變和基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化、遷移、分裂和黏附能力［8］。為了研究細(xì)胞骨架在內(nèi)皮細(xì)胞生理功能中的作用，本研究利用細(xì)胞骨架聚合劑JAS促進(jìn)微絲的聚合，改變肌動蛋白細(xì)胞骨架。結(jié)果顯示:JAS對HUVECs細(xì)胞骨架的作用具有時間依賴性，JAS短時間(譬如15 min或1 h)作用于HUVECs，細(xì)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)明顯增多;而JAS長時間作用(24 h)，則可致細(xì)胞結(jié)構(gòu)皺縮，微絲結(jié)構(gòu)變得模糊不清，聚集成團(tuán)塊狀?？赡艿臋C(jī)制為短時間JAS作用可誘導(dǎo)G-Actin聚合成F-Actin，即微絲，及競爭性結(jié)合F-Actin，穩(wěn)定微絲，而長時間的JAS作用則對細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用［9］。同時，我們在預(yù)實驗中選擇了3種濃度，分別為50、100及200 nmol·L－1，其中 50 nmol·L－1對細(xì)胞骨架影響不明顯，而200 nmol·L－1表現(xiàn)的則為毒性作用，因此在后續(xù)對HUVECs功能的研究中我們選擇的JAS的作用濃度為100 nmol·L－1，作用時間為1 h。

內(nèi)皮細(xì)胞的功能很大程度上依賴于細(xì)胞的增殖、粘附、遷移及成血管等能力。就增殖而言，有研究表明細(xì)胞骨架的改變可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖［10］，但抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖［11］。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，JAS作用后，對HUVECs增殖的影響并不明顯。以上結(jié)果提示細(xì)胞骨架對細(xì)胞增殖的影響，在不同的細(xì)胞有所不同。

Fig 5 Effect of JAS on cell tube formation capability of HUVECs

另外，我們結(jié)果顯示，以JAS聚合細(xì)胞骨架后可增強(qiáng)HUVECs的黏附及遷移。細(xì)胞骨架中的肌動蛋白是維持細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞黏著的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［12］，培養(yǎng)細(xì)胞的黏著位點為黏附斑，其外部結(jié)構(gòu)為整合素等蛋白。研究證實內(nèi)皮細(xì)胞的黏附主要由細(xì)胞表面的整合素 α5β1 and αVβ3 調(diào)控［13］，因此 JAS 促進(jìn)黏附的機(jī)制可能是細(xì)胞骨架聚合促進(jìn)了細(xì)胞表面整合素β1及β3的表達(dá)。細(xì)胞遷移的主要過程為細(xì)胞外部信號引起細(xì)胞的極化，從而使細(xì)胞沿移動方向形成突起，細(xì)胞的突起與基底形成黏附，這些黏附點作為細(xì)胞收縮的支點。當(dāng)細(xì)胞收縮時，細(xì)胞整體向前移動，細(xì)胞尾部與基底的黏附點得以釋放［14－16］。肌動蛋白參與了細(xì)胞突起的形成［17］，因此其對內(nèi)皮細(xì)胞的遷移影響至關(guān)重要。類似于肌動蛋白在血小板的偽足形成、變形、收縮等生理過程中所起的重要作用［18］。細(xì)胞松弛素B和D被發(fā)現(xiàn)可通過抑制肌動蛋白聚合來抑制成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和神經(jīng)膠原瘤細(xì)胞的遷移［19－20］。JAS與細(xì)胞松弛素B和D的作用相反，是一種肌動蛋白聚合劑，與之對應(yīng)的，本實驗結(jié)果表明肌動蛋白被JAS聚合后，HUVECs的遷移能力明顯增強(qiáng)。

內(nèi)皮細(xì)胞在血管的完整性及血管的形成中起非常重要的作用，其成血管能力的強(qiáng)弱直接關(guān)系著新生血管的形成和血管的自身修復(fù)。為了研究細(xì)胞骨架對HUVECs成血管能力的影響，本實驗利用JAS促進(jìn)微絲的聚合，改變肌動蛋白聚合、分離的動態(tài)變化過程。結(jié)果顯示，JAS可增強(qiáng)HUVECs的體外成血管能力。內(nèi)皮細(xì)胞成血管能力主要受細(xì)胞增殖、黏附及遷移等多種因素的影響。JAS作用后盡管HUVECs的增殖沒有發(fā)生明顯的改變，但其黏附及遷移能力增強(qiáng)，這必將有助于HUVECs的體外成血管能力。

本實驗通過利用JAS促進(jìn)微絲的聚合，初步探討了肌動蛋白細(xì)胞骨架對培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞生物特性的影響，發(fā)現(xiàn)JAS短時間預(yù)處理可穩(wěn)定細(xì)胞骨架，促進(jìn)Actin骨架蛋白的聚合，進(jìn)而提高HUVECs的黏附、遷移及體外成血管能力，但是細(xì)胞骨架在內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)控中的具體機(jī)制及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是極其復(fù)雜的，有待進(jìn)一步研究。

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