李 鑫，張 迪，鄭久明，劉新宇，劉春娜*

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，2.錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州 121001)

高血壓一直是心血管系統(tǒng)疾病研究的熱點(diǎn)及前沿。近年來，其患病率不斷上升且由此引發(fā)的心腦血管病致死率的持續(xù)增加，使其越來越受到廣泛的重視［1］。長期血壓增高可致左室心肌產(chǎn)生重構(gòu)，左室心肌細(xì)胞電生理特性也可發(fā)生改變。有研究表明，新型神經(jīng)血管活性肽優(yōu)洛可定(urocortin，UCN)在心肌缺血/再灌注損傷中對心肌有保護(hù)作用，并可明顯而持久的降低血壓，但確切的機(jī)制目前尚不十分清楚［2－3］。為深入研究UCN對心血管疾病的藥理作用，尋找安全而有效的治療高血壓、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的藥物，本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，觀察UCN對SHR血流動力學(xué)方面、逆轉(zhuǎn)左室重構(gòu)及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，從而對UCN在心血管系統(tǒng)中的作用及機(jī)制有更深入的了解，為治療高血壓及其他心血管疾病提供新的藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品 健康♂ Wistar Tokyo(WKY)大鼠，及spantaneous hypertension rat(SHR)大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，18周齡，由上海中科院動物研究中心提供。優(yōu)洛可定，sigma公司(美國)，批號:171543-83-2。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為6組，包括:WKY對照組(WKY);SHR對照組(SHR):Urocortin小劑量組(UCN1)、中劑量組(UCN2)、大劑量組(UCN3);維拉帕米(VER)組。UCN組及VER組均采用 SHR 大鼠 6 只，Urocortin(1、3、6 μg·kg－1·d－1)每日經(jīng)尾靜脈注射給予，VER(10 mg kg－1·d－1)用三蒸水溶解后每日灌胃給予，用藥2周。SHR對照組及WKY組每日經(jīng)尾靜脈注射給予生理鹽水0.5 ml。給藥期間每日監(jiān)測各組實(shí)驗(yàn)動物尾動脈血壓變化情況。

1.3 血流動力學(xué)測定 給藥2周后，各組實(shí)驗(yàn)動物以20% 烏拉坦(1 g·kg－1)麻醉，仰臥位固定，測量術(shù)前標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖并存入電腦，分離左頸總動脈，將壓力感受器前端塑料引管自近心端插入左心室，記錄血流動力學(xué)方面指標(biāo)，包括平均動脈壓(AMP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室收縮壓(LVSP)以及左心室壓力最大變化速率(±dp/dtmax)。

1.4 心肌細(xì)胞急性分離 血流動力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即開胸取出心臟，通過主動脈插管把心臟掛在Langendorff灌流裝置上，用臺氏液灌流大約30 s;之后用無鈣臺氏液灌流5～7 min使心臟停跳;用Ⅱ型膠原酶消化液消化15 min，并用無鈣臺氏液快速沖洗心臟3～5 min停止消化，急性分離心肌細(xì)胞。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄 將上述一半急性分離的心肌細(xì)胞用于記錄全細(xì)胞跨膜L-型鈣通道變化情況，保持電壓(holding potential，HP)－40 mv，檢測電位(test potential，TP)從－40 mV 到 +50 mV，階躍10 mV，脈寬200 ms，間隔3 s，以平均膜電流與膜電容之比表示其電流密度(Id)，單位為pA/pF。

1.6 自發(fā)性高血壓大鼠心室肌細(xì)胞中熒光鈣含量測定 上述急性分離的心肌細(xì)胞進(jìn)行離心，3 000 r·min－1，離心 5 min，棄上清，加入 800 μl普通 PBS緩沖液離心5 min，棄上清，加入300 μl無鈣PBS緩沖液離心5 min，再棄去上清，加入10 μl Furo 3，震蕩，搖勻，37℃ 水浴15 min之后用流式細(xì)胞儀測定心肌細(xì)胞內(nèi)熒光鈣含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 膜片鉗數(shù)據(jù)采用IGOR軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示。兩組平均值的比較用非配對t檢驗(yàn)。兩組以上的均值比較用隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Urocortin 對 SHR 大鼠 AMP、LVSP、LVEDP的影響 SHR對照組 AMP、LVSP、LVEDP與 WKY組比較明顯升高，二者差異存在顯著性(P＜0.01)。與SHR對照組比較，UCN 3個(gè)劑量組組和VEA組，AMP、LVSP、LVEDP數(shù)值均明顯降低 (P＜0.01)。

2.2 Urocortin對自發(fā)性高血壓大鼠左室壓最大變化速率的影響 +dp/dtmax及－dp/dtmax數(shù)值是反映左心室收縮功能的主要指標(biāo)之一。如Tab 1所示，在SHR對照組中±dp/dtmax數(shù)值與WKY組比較明顯降低。然而，±dp/dtmax數(shù)值在WKY組、UCN組以及VER組都明顯升高，與SHR對照組比較差異均存在顯著性(P＜0.01)。

2.3 UCN對L-型鈣通道電流密度影響 與WKY組(3.635±0.156)pA/pF比較，SHR組(5.2967±0.335)pA/pF心室肌細(xì)胞L-型鈣通道最大電流密度明顯升高(P＜0.01)。各UCN組及VER(2.465±0.380)pA/pF組與SHR組相比，L-型鈣通道最大電流密度明顯降低，其中UCN1組降到(4.271±0.392)pA/pF，UCN2 組為(3.087±0.418)pA/pF，UCN3組抑制最為明顯，降低到(2.582±0.205)pA/pF(P＜0.01)，而AST組的電流強(qiáng)度與SHR組比較無明顯改變(5.114±0.422)pA/pF(P＞0.01)。

Fig 1 Effects of urocortin on density of SHR cardiomyocytes(±s，n=6)

2.4 細(xì)胞內(nèi)熒光鈣含量的測定 流式細(xì)胞儀測定急性分離的心室肌細(xì)胞內(nèi)熒光鈣含量結(jié)果顯示，SHR對照組心肌細(xì)胞內(nèi)熒光鈣含量(256.1±11.2)mg·L－1明顯升高，與 WKY 組(120.5 ±14.4)mg·L－1比較差異存在顯著性(P＜0.01)。UCN組與VER組中鈣含量與WKY組相近。然而，與SHR對照組相比，UCN 組［UCN1，(151.5±12.5)mg·L－1，P＜0.01;UCN2，(113.3 ±8.7)mg·L－1，P＜0.01;UCN3，(115.6 ±7.3)mg·L－1，P＜0.01］與VER組(95.9±5.4)mg·L－1中熒光鈣含量明顯降低，差異存在顯著性。另外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CRF-R2受體阻斷劑astressin后，再應(yīng)用urocortin，并不能降低心室肌細(xì)胞內(nèi)熒光鈣含量(205.7±12.8)mg·L－1，與SHR對照組比較差異無顯著性(P＞0.01)。

Tab 1Effects of urocortin on hemodynamic index(±s，n=6)

Tab 1Effects of urocortin on hemodynamic index(±s，n=6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SHR group.

WKY SHR UCN1 UCN2 UCN3 VER AMP 69.75 ±2.18 115.4 ±10.63 104.1 ±9.27 69.87±7.58 70.56 ±8.91 72.46 ±6.96 LVSP 118.0 ±4.7 214.5 ±10.4 171.2 ±12.5 123.7 ±9.4 135.8 ±11.6 140.5 ±9.9 LVEDP 0.67 ±0.11 2.51 ±0.59 1.36 ±0.33 0.74 ±0.14 0.87 ±0.25 0.68 ±0.29+dt/dp 8692±351 5621±407 6059±425 6687±394 7746±453 6643±456－dt/dp －8272±269 －4750±473 －5934±652 －6876±619 －7125±542 －7057±539

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用不同劑量UCN，以觀察分析UCN對自發(fā)性高血壓大鼠血流動力學(xué)等方面的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SHR組中AMP、LVSP、LVEDP明顯升高，同時(shí)+dp/dtmax及－dp/dtmax明顯降低，表明血流動力學(xué)方面損傷明顯。應(yīng)用不同濃度UCN后，AMP、LVSP、LVEDP明顯降低，同時(shí) +dp/dtmax及－dp/dtmax明顯改善，提示應(yīng)用UCN能降低血壓，解除心肌組織的超負(fù)荷狀態(tài)，不僅心肌力學(xué)性質(zhì)恢復(fù)正常，而且也可能為已發(fā)生肥厚的心肌組織提供逆轉(zhuǎn)肥厚的可能。

Fig 2 Contents of fluorimetric calcium in cardiomyocytes in SHR(±s，n=6)

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，UCN能阻斷鈣離子內(nèi)流，降低細(xì)胞內(nèi)和線粒體中鈣離子濃度，避免細(xì)胞內(nèi)和線粒體鈣超負(fù)荷;UCN能有效降低心肌細(xì)胞內(nèi)熒光鈣離子含量，逆轉(zhuǎn)大鼠心肌纖維化及心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷現(xiàn)象。隨心肌纖維化和細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷的逆轉(zhuǎn)，不同濃度UCN用藥組大鼠左室舒張、收縮功能均明顯改善。研究表明，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平衡取決于細(xì)胞外Ca2+通過L-型Ca2+通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速度和數(shù)量以及肌漿網(wǎng)(SR)對Ca2+的攝取、儲存和釋放，而后者更為重要。SR通過鈣泵(SERCA-a)、鈣泵調(diào)節(jié)蛋白—受磷蛋白(phospholamban，PLB)等調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和正常心肌收縮、舒張功能［4－6］。研究發(fā)現(xiàn)肌漿網(wǎng)鈣泵活性降低，與Ca2+親和力降低，因此可導(dǎo)致Ca2+-ATP酶對胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+再攝取功能減低，細(xì)胞內(nèi) Ca2+超負(fù)荷，出現(xiàn)心肌舒張功能障礙［7－8］。在心肌細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，UCN 能抑制L-型鈣通道開放，是抑制心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷發(fā)生的重要分子機(jī)制之一。細(xì)胞膜L-型鈣通道在細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)中發(fā)揮重要作用，UCN能夠阻斷血管平滑肌的L-型Ca2+通道，Ca2+減少后引起血管平滑肌去偶聯(lián)，而產(chǎn)生擴(kuò)血管效應(yīng)，進(jìn)而降低AMP、LVSP、LVEDP，改善血流動力學(xué)。UCN減少鈣通道開放，減輕鈣超載，從而改善高血壓大鼠收縮和舒張功能，同時(shí)減輕心室肥厚，在高血壓及心血管疾病中起保護(hù)作用。UCN作為一種新型的小分子血管活性肽，它通過自分泌和/或旁分泌途徑，其作用是廣泛的，相應(yīng)作用機(jī)制也較復(fù)雜［9－10］，需要在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討和研究。

綜上所述，在自發(fā)性高血壓大鼠中UCN將血壓降至正常水平時(shí)，可消退左室肥厚和改善左室收縮及舒張功能，其可能的機(jī)制是UCN與相應(yīng)的CRF-2R結(jié)合，通過抑制L-型鈣通道開放，降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、減輕鈣超載，在高血壓等心肌疾病中發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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