馬佳佳，Nick Lu，陳必良

(1.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710032;2.Department of Allergy-immunology，Northwestern University USA Chicago 60611)

妊娠期哮喘是圍生期常見合并癥，其病因及發(fā)病機制目前仍未闡明。大多數(shù)學者認為妊娠期哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)與母體多項炎癥及免疫因子水平變化有關［1］。有資料證實［2］，人腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factoralpha，TNF-α)與各種原因?qū)е碌娜焉锷砗?或)病理現(xiàn)象如免疫性疾病、感染的炎癥過程等密切相關，其廣泛的生物學功能通過與細胞表面膜受體可溶性腫瘤壞死因子受體1(soluble tumor necrosis factor receptor 1，sTNFR1)的結(jié)合來實現(xiàn)。TNF-α在影響淋巴細胞活化的同時，對機體產(chǎn)生的保護和損傷雙重作用決定哮喘的臨床表現(xiàn)［3］。細胞表面 IgGFcγ 受體(Fc gamma receptors，F(xiàn)cγRs)是維持機體外周免疫耐受平衡的關鍵受體［4］，通過依賴胞質(zhì)區(qū)免疫受體抑制基序信號轉(zhuǎn)導通路的方式，參與多種免疫應答的啟動與調(diào)節(jié)，對免疫細胞激活和增殖所產(chǎn)生的抑制效應，已在炎性疾病的控制上顯示出巨大的潛力和價值［5］。本研究擬以基因工程手段將sTNFR1與人免疫球蛋白IgG1 Fc片段偶聯(lián)，制備雙體性嵌合基因的重組腺病毒，以探討其功能和抑制細胞外周免疫耐受偏移、失衡及其中和阻斷TNF-α活性能力，為靶向干預治療妊娠哮喘疾病作用機制研究提供新的解釋和依據(jù)。

1 材料

1.1 標本來源 妊娠期哮喘婦女清晨空腹外周血10 ml取自第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科住院患者(知情同意，按中華醫(yī)學會《支氣管哮喘防治指南》確診)。

1.2 主要試劑 腺病毒載體AdEasyTM系統(tǒng)包括穿梭載體pAdTrack-CMV、骨架載體 p AdEasy-1，E.coli DH5α、BJ5183均由美國芝加哥西北大學過敏和免疫學系Nick Lu博士惠贈。人胚腎AD293細胞為本室保存。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶(美國New England Biolabs);TNF-α、兔抗人sTNFR1多克隆抗體(美國 I nvitrogen);CD4-異硫氰基(FITC)、CD25-藻紅蛋白(PE)、Foxp3-別藻藍蛋白(APC)(美國Cell Signaling Technology);人 I L-12、IL-4 ELISA 試劑盒(美國Rapid Bio Lab);MTT(美國Sigma)。

1.3 引物序列 根據(jù)GenBank中報道的sTNFR1，IgGFc基因序列設計特異引物，由上海生物工程技術服務有限公司合成及測序。sTNFR1-F:5'-GAGCGAATCCATGGATAGTGTGTGTCCCCTCCGCTT-3';sTNFR1-R:5'-GTCGGTCGACGGATCCTCAAATGATCAGGGGCAACG-3'(下劃線為Hind III和EcoRI酶切位點)。IgGFc-F:5'-CGGTATGAATTCATGTGGCAGCTGCTGGTACCATC-3';IgGFc-R:5'-CCCTAACCTCGAGTTATCCTCCTTTGTCCTATCTG-3'(下劃線為Hind III和Kpn I酶切位點)。

2 方法

2.1 細胞分離與誘導培養(yǎng) Ficoll法分離獲得妊娠期哮喘婦女外周血單個核細胞，PBS調(diào)懸浮細胞密度5×106·L－1接種 RPMI 1640培養(yǎng)基，加入5 mg·L－1PHA-P增殖培養(yǎng)48～72 h，離心培養(yǎng)液－80℃凍存。按免疫磁珠分選試劑說明操作，經(jīng)FITC-CD45，PE-CD3表面標記，流式細胞術(FCM)測定T細胞純度用于后續(xù)實驗。

2.2 目的基因克隆及穿梭質(zhì)粒重組 提取對數(shù)生長期肥大細胞(MC)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別以sTNFR1-F/R、IgGFc-F/R為引物擴增目的基因sTNFR1和 IgGFc。退火溫度58℃，共25個循環(huán)。凝膠電泳鑒定后以sTNFR1、IgGFc產(chǎn)物為模板，sTNFR1-F、IgGFc-R為引物進行重疊PCR。退火溫度60℃，共25個循環(huán)。純化拼接片段通過HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切插入pAdTrack-CMV載體，經(jīng)T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，篩選的陽性克隆HindⅢ、KpnⅠ雙酶切并行測序和Blast比對。

2.3 同源重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建 Pme I酶切pAdT-sTNFR1-Ig線性化片段轉(zhuǎn)入含pAdEasy-1的BJ5183中發(fā)生同源重組，卡那霉素LB平板37℃振搖過夜，抽提質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切鑒定，命名AdE-EGFP-sTNFR1-Ig，空腺病毒載體作為對照，命名AdE-EGFP。

2.4 腺病毒包裝、擴增與鑒定 純化質(zhì)粒用LipofectamineTM2000介導轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)傳代、融合度達90%的AD293細胞，待細胞病變(cytopathic effect，CPE)效應廣泛形成后收集細胞，于37℃/－70℃間反復凍融4次，以1×105/孔接種96孔板，加入梯度稀釋(10－5～10－13)的病毒液 100 μl/孔，另設不含病毒對照。熒光顯微鏡下計數(shù)CPE形成并測定滴度。同時，以重組腺病毒及同法包裝的空載腺病毒感染細胞cDNA為模板，按前述條件及引物行PCR鑒定。

2.5 重組腺病毒感染效率測定 將MC接種于24孔板，加無血清RPMI 1640培養(yǎng)24 h后，按預實驗篩選CPE所對應病毒滴度的最佳結(jié)果，加入感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為50的病毒液，37℃、5%CO2孵育48 h，收獲細胞命名sTNFR1-Ig-MCs和 EGFP-MCs，分別于感染第 2、5、7 天熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光表達。

2.6 重組腺病毒在細胞中的表達檢測 提取感染細胞RNA，以cDNA產(chǎn)物為模板，按前述引物及條件RT-PCR鑒定sTNFR1-Ig基因mRNA表達，10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時取20 μg細胞總蛋白，以sTNFR1多克隆抗體(1∶500)為一抗、羊抗小鼠IgG-HRP(1∶2 000)為二抗，用Western blot檢測目的蛋白表達，實驗重復3次。

2.7 Foxp3表達百分率FCM檢測 將感染MC與培養(yǎng)純度達95%的T細胞按1∶5比例(MC細胞1×105/孔，T細胞5×105/孔)混合于96孔板中培養(yǎng)，另設單純T細胞對照孔。48 h后收獲細胞給予0.05 ng·L－1佛波酯、0.5 ng·L－1離子霉素和 2 μg·L－1莫能霉素共同刺激4 h，使用10 g·L－1皂苷破膜。按抗體說明 EP管中先后加入 CD4-FITC，CD25-PE和Foxp3-APC，對照管中加入相應同型對照，室溫避光反應30 min。以PBS/多聚甲醛重懸細胞上機檢測，數(shù)據(jù)采用FlowJoV7.3軟件分析。

2.8 細胞因子水平ELISA檢測 收集的混合細胞培養(yǎng)上清中加入不同細胞因子繼續(xù)誘導培養(yǎng)，并設立完全空白對照，72 h后收獲細胞。按試劑盒說明書操作進行 IL-12和 IL-4檢測，結(jié)果以 ng·L－1表示。

2.9 細胞毒效應MTT檢測 調(diào)轉(zhuǎn)染MC 5×104/孔接種96孔板，37℃孵育過夜，將倍比稀釋的細胞上清(10、20、40、60 和 80 mg·L－1)與 10 μg·L－1TNF-α和2 mg·L－1絲裂霉素C混均，培養(yǎng)24 h每孔加入 5 g·L－1MTT 20 μl繼續(xù)孵育4 h，DMSO150 μl水平震蕩裂解細胞，每組3個復孔并設空白對照孔。酶標儀590 nm波長測定吸光度值，計算sTNFR1-Ig拮抗TNF-α對靶細胞毒效應百分率/%=(實驗組吸光度－對照組吸光度)×100%。

2.10 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，結(jié)果以±s表示，細胞活性組間比較采用方差分析和t檢驗。

Fig 1 Cloning of target gen and construction of shuttle vector

3 結(jié)果

3.1 目的基因克隆及穿梭載體酶切鑒定 PCR擴增的sTNFR1(558 bp)和IgGFc(232 bp)cDNA片段大小與預期一致，兩者嵌合后的產(chǎn)物片段長約786 bp(Fig 1A)?？寺∪雙AdTrack-CMV后可見約786 bp的條帶(Fig 1B)，測序結(jié)果證實插入的基因片段位置正確，表明重組穿梭載體含有的sTNFR1-IgGFc基因cDNA序列與設計相符。

3.2 同源重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 Pme I酶切線性化 pAdT-sTNFR1-Ig與 pAdEasy-1在BJ5183中完成同源重組，經(jīng)Pac I酶切后產(chǎn)生30 kb和4.5 kb特征性DNA條帶(Fig 2)，再次證實重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒同源重組成功。

3.3 重組腺病毒的生成及CPE效應 線性化重組腺病毒包裝細胞48 h后熒光顯微鏡下可見綠色熒光存在于細胞內(nèi)，且強度隨時間的延長逐漸增強，表明細胞內(nèi)已有腺病毒復制。至5 d時細胞呈彗星狀;重復感染細胞至7 d時，細胞由貼壁狀態(tài)變圓懸浮甚至脫落，折光性增強并形成完全CPE效應，滴度達3.7×1010～4.8×1010pfu/ml;而空腺病毒載體感染細胞僅有少量GFP且熒光強度較弱，未見明顯病毒增殖(Fig 3A)。瓊脂糖電泳顯示特異性預期大小786 bp目的片段(Fig 3B)，表明腺病毒包裝與擴增成功。

Fig 2 Construction and verification of the recombinant adenovirus plasmid by agarose gel electrophoresis

3.4 重組腺病毒在細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達 感染細胞48 h后熒光顯微鏡觀察約有90%以上的細胞表達GFP(Fig 4A，B);PCR擴增獲得786 bp大小清晰條帶(Fig 4C);Western blot分析可見顯色后的蛋白樣品于95 ku處明顯上調(diào)(Fig 4D)，表明sTNFR1-Ig mRNA及蛋白能夠在感染MC中得到轉(zhuǎn)錄和表達。

3.5 重組腺病毒對T細胞表達Foxp3影響 細胞混合培養(yǎng)上清中CD4+CD25+Foxp3+T細胞水平明顯增高，IL-4水平降低(P＜0.05)，證實sTNFR1-Ig可促進Foxp3+Treg的產(chǎn)生，從而導致Th2/Treg所占CD4+T細胞比值下降(P＜0.05，F(xiàn)ig 5)。

Fig 3 Cytopathic effect of AD293 cells packed by recombinant adenovirus and PCR amplification

3.6 重組腺病毒對細胞因子免疫抑制 如Tab 1所示，與空白對照相比較，混合培養(yǎng)上清中sTNFR1-Ig-MCs組IL-12水平明顯增高，而IL-4維持在較低水平(P＜0.05)，EGFP-MCs組的各因子變化趨勢不明顯。

Fig 4 Verification of recombinant adenovirus infected MC cells

3.7 重組腺病毒拮抗TNF-α活性能力 不同濃度細胞培養(yǎng)上清均能中和TNF-α對靶細胞的免疫毒性，60 mg·L－1時 sTNFR1-Ig仍可與 TNF-α 特異結(jié)合，完全抑制TNF-α的毒性效應(P＜0.05);空腺病毒載體與空白對照細胞培養(yǎng)上清對TNF-α毒性效應的拮抗作用不足(Fig 6)。

Fig 5 Detection of Th2/Treg level in infected MC cells and T cells co-culture system by FCM

4 討論

大量的研究資料表明，TNF-α作為機體炎癥起始性、甚至損傷的重要介質(zhì)，通過受體作用的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡，誘導并促進一系列與炎癥有關的細胞因子的黏附表達、肺部遷移和浸潤［6］，增加對MC細胞的趨化作用，釋放的炎性介質(zhì)參與哮喘氣道炎癥的形成和疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程，對維持氣道炎癥的持續(xù)存在起到了關鍵作用。然而，sTNFR競爭性封閉TNF-α介導炎癥反應作用受到更多重視［7］。

Tab 1 Comparison of cytokine levels in different cell groups(±s，ng·L －1)

Tab 1 Comparison of cytokine levels in different cell groups(±s，ng·L －1)

*P＜0.05 vs control group，EGFP-MCs group

Group IL-12 IL-4 Th1/Th2__Control 158.8 ±13.9 535.2 ±27.6 7.2 ±0.9 EGFP-MCs 166.5 ±11.1 497.5 ±24.1 9.3 ±1.2 sTNFR1-Ig-MCs 383.9 ±20.9*_236.6 ±17.4*__21.1 ±___3.7*__

Fig 6 Inhibition of TNF-α-dependent cytotoxicity by Ad-EGFP-TNFR1-Ig in vitro(±s)

AdEasyTM系統(tǒng)是將sTNFR1-Ig基因成功轉(zhuǎn)入細胞的理想載體。目前，以此作為載體分析其對妊娠哮喘的免疫調(diào)節(jié)作用尚缺乏實驗。本研究采用基因拼接方法獲得了全編碼嵌合基因，酶切鑒定和基因測序證實，其同源重組率與傳統(tǒng)細胞內(nèi)重組法相比較更為有效，也使進一步的病毒包裝以及感染效率檢測更為便捷［8］。本實驗數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)導載體48 h后即可觀察到目的基因表達;GFP陽性細胞感染性病毒滴度的遞增，以及雜交出的條帶均說明，裂解期sTNFR1-Ig基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到感染細胞以及靶細胞的基因組中。提示骨架質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒發(fā)生了有效同源重組，獲得病毒繁殖感染性滴度高效且穩(wěn)定，能夠滿足實驗的要求。

一直以來，Th2優(yōu)勢應答及Th1/Th2細胞失衡被認為是哮喘發(fā)病的核心環(huán)節(jié)［9］。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細胞的失衡只是哮喘發(fā)病的表面現(xiàn)象，而機體對外源變應原的免疫耐受遭到破壞，Th2/Treg細胞失衡更代表了哮喘的免疫學發(fā)病基礎［10］。尤其是Treg表達調(diào)節(jié)T細胞特異性Foxp3細胞核內(nèi)蛋白，能直接拮抗Th2細胞相關因子產(chǎn)生和EOS在氣道內(nèi)的聚集以及MC的致炎作用，在維持機體免疫耐受抑制炎癥反應性疾病過程中發(fā)揮重要作用。

在闡明Th2對Treg細胞免疫抑制抵抗在妊娠期哮喘的可能作用及相關機制方面，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)sTNFR1-Ig修飾的混合培養(yǎng)上清中IL-12呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，表明存在Treg及Th1細胞的功能障礙。筆者認為，引發(fā)這種變化的原因是隨著病情發(fā)展，妊娠哮喘母體內(nèi)的sTNFR1水平已處于相對不足狀態(tài)，由于拮抗TNF-α細胞毒能力減低，無法有效抑制CD4+IL-4+Th2細胞活化閾值，以及改變炎癥激活細胞內(nèi)抑制信號引發(fā)的機體免疫調(diào)節(jié)失衡，從而導致Th0向Th1方向分化受阻，加劇了Th2細胞功能亢進狀態(tài)。Th2/Treg細胞間的平衡改變，免疫抑制抵抗力的減低，均促使妊娠母體對病毒的易感性增加。本結(jié)果與哮喘發(fā)生時Th2細胞關鍵效應占主導地位狀態(tài)及病理過程相似，與文獻報道Treg細胞的低表達，可能是引發(fā)哮喘發(fā)病機制［11］的學說觀點不謀而合。表明重組腺病毒感染所致體內(nèi)Treg水平恢復對Th2細胞裂解性周期復制形成抵抗，與疾病活動期sTNFR1-Ig基因修飾后的MC對同種T細胞的刺激明顯下調(diào)有關。

筆者推測，sTNFR1-Ig對抑制妊娠期哮喘發(fā)作可能充當了“推動”和(或)“支持”性抗體作用，通過阻斷TNF-α與TNFR的有效結(jié)合，使TNF-α的異常分泌狀態(tài)隨病情緩解呈減弱趨勢，從而減輕患者肺部的病理損傷。本研究結(jié)果進一步證實sTNFR1-Ig參與的免疫調(diào)控與妊娠期哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關，說明sTNFR作為膜受體的清除形式使細胞對TNF系統(tǒng)的反應性下降;Treg通過調(diào)控Th細胞，分泌TGF-β來發(fā)揮專職性抑制并消除Th2細胞對其的抵抗，進而恢復Th1/Th2及Treg細胞平衡，這種雙向性變化在調(diào)節(jié)妊娠哮喘感染的免疫應答發(fā)病機制中起重要作用。

為評估sTNFR1-Ig的免疫活性，本研究采用MTT法對腺病毒轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清中殘存TNF-α細胞毒活性進行了檢測。結(jié)果證實，表達sTNFR1-Ig的上清可有效中和并減低TNF-α濃度。說明含有Fc片段類雙價抗體似的嵌合蛋白既可特異地與TNF-α結(jié)合，加速了體內(nèi)免疫復合物的清除。兩者的偶聯(lián)，通過抗體依賴細胞介導的細胞毒作用，具有比sTNFR單體更強的免疫抑制能力，延長其體內(nèi)半衰期，這不僅競爭性地抑制TNF-α與膜受體的結(jié)合［12］，而且在轉(zhuǎn)錄水平還可拮抗TNF-α毒性作用的發(fā)揮并使其生成受到影響。此現(xiàn)象或許能夠解釋在妊娠期哮喘發(fā)病過程中，當母體受到TNF-α病理損傷時，可通過sTNFR1-Ig啟動體內(nèi)免疫保護機制，阻斷TNF-α的信號通路使病情得到緩解。本結(jié)果可以推斷，TNF-α不僅從多方面參與了妊娠期哮喘的免疫損傷，或者說妊娠期哮喘發(fā)生發(fā)展過程中存在TNFR基因的水平變化，這些都為妊娠期哮喘機制研究及生物治療提供支持并帶來希望。

總之，探求sTNFR1-Ig在體內(nèi)參與妊娠期哮喘病理生理改變的途徑和作用仍需大量體內(nèi)、外及細胞學之間的實驗研究來證實。本研究重組腺病毒載體的成功構(gòu)建，對闡明sTNFR1-Ig基因信號傳導通路關節(jié)點，從蛋白和(或)基因水平找到探索妊娠期哮喘發(fā)病機制新線索，提供了很好的研究方向，為重新審視和制定妊娠期哮喘免疫靶向干預提供了新的思路和切入點。

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