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        IGF2在小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為胰島樣細(xì)胞過程中的表達(dá)*

        2013-12-03 03:50:54湯佳珍朱凌燕甘華俠
        天津醫(yī)藥 2013年11期
        關(guān)鍵詞:印跡胰島等位基因

        劉 峰 湯佳珍 朱凌燕 甘華俠

        胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES細(xì)胞)具有無限增殖和全能分化的潛力,理論上ES細(xì)胞具有分化為各種細(xì)胞的潛能[1],目前已成功將ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多種終末組織細(xì)胞,成為細(xì)胞和器官移植領(lǐng)域最具潛在優(yōu)勢的資源[2-3]。基因組印跡是指某些基因呈不遵從孟德爾定律依靠單親傳遞某些遺傳學(xué)性狀的現(xiàn)象,也就是某些基因呈親源依賴性單等位基因表達(dá)[4],是目前表觀遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。有研究顯示,體外長期培養(yǎng)的ES細(xì)胞,其表觀遺傳學(xué)呈現(xiàn)不穩(wěn)定趨勢[5]。經(jīng)體外受精(IVF)得到的ES細(xì)胞,存在基因組印跡異常[6]。鼠胰島素樣生長因子(IGF)2基因位于7號(hào)染色體上,是最早發(fā)現(xiàn)的印跡基因,胰腺的IGF2只從父本染色體表達(dá)。本研究旨在通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP),檢測印跡基因IGF2在誘導(dǎo)分化細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討體外誘導(dǎo)培養(yǎng)對基因組印跡的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料 小鼠ES細(xì)胞系由美國斯坦福大學(xué)Andrew.R.Hoffman惠贈(zèng)。試劑:Knock-out DMEM、DMEM/F12、L-谷氨酰氨、胎牛血清(FBS)和TRIzol購自Invitrogen公司,白血病抑制因子(LIF)購自Chemicon公司,全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,RA)和尼克酰胺(nicotinamide,NIC)購自Sigma公司,N2添加物、B27添加物購自GIBCOBRL公司,Activin A購自Ramp;D公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq DNA聚合酶購自Fer?menta公司,限制性內(nèi)切酶購自NEB公司,胰島素單克隆抗體購自abcam公司,C肽單克隆抗體購自Licon公司。

        1.2 方法

        1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測誘導(dǎo)分化后胰島細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)情況 按常規(guī)法培養(yǎng)擴(kuò)增ES細(xì)胞,參照Shi等[7]的三階段法誘導(dǎo)培養(yǎng)。分化各階段細(xì)胞總RNA按TRIzol說明書提取,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列及PCR的條件見表1。反應(yīng)體系為10 μL,具體如下:10×緩沖液1.0 μL,MgCl2(25 mmol/L)0.8 μL,dNTPs(10 mmol/L)0.2 μL,Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL,引物(10 μmol/L,正反引物Mix)0.2 μL,cDNA模板(0.1 g/L)0.2 μL,ddH2O 7.6 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min后,94 ℃變性30 s,60℃(β-actin為58℃)退火30 s,72℃延伸30 s,完成30個(gè)循環(huán),72℃5 min,瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下攝像觀察。

        Table 1 The primer sequence of islet-specific genes表1 胰島細(xì)胞特異表達(dá)基因引物序列

        1.2.2 免疫熒光染色 分化成熟的第3階段細(xì)胞,免疫熒光檢測胰島素及C肽,收集的分化細(xì)胞用PBS洗去細(xì)胞中的培養(yǎng)基,加4%的多聚甲醛溶液室溫下固定細(xì)胞;加一抗,室溫1 h或4℃過夜孵育,加磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍;孵育二抗,室溫孵育1 h;PBS洗4次,每次5~10 min,然后用5%BSA室溫封閉30 min;加DAPI(1∶1 000稀釋)染核,室溫避光孵育5 min,用PBS清洗2遍;將DAPI/Antifade Solution稀釋30倍,滴適量到蓋玻片上,室溫染色20 min;PBS洗3次,每次5 min;封片劑封片,37℃烤片10 min,激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

        1.2.3 PCR-RFLP法分析誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞印跡基因IGF2親本表達(dá) 以分化前后細(xì)胞cDNA為模板,用特異性引物擴(kuò)增印跡基因 IGF2,引物序列:5'-TGGCCCTCCTGGAGA?CRTACTGTGC-3',5'-CTGTCCCTGCTCAAGAGGAGGTCA-3',PCR產(chǎn)物(380 bp)用特異的限制性內(nèi)切酶(BsaAI);酶切產(chǎn)物(380、321、59 bp)在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,溴乙錠染色,紫外投射儀上觀察電泳結(jié)果并攝像。

        2 結(jié)果

        2.1 誘導(dǎo)分化各階段細(xì)胞胰島細(xì)胞性標(biāo)志物的表達(dá)情況 胰島素、胰高糖素、生長抑素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2在未分化的ES細(xì)胞中不表達(dá),在誘導(dǎo)分化第2階段末和第3階段末的細(xì)胞都有表達(dá),且在第3階段比第2階段要強(qiáng),見圖1。

        2.2 最終分化細(xì)胞特異性蛋白表達(dá) 誘導(dǎo)分化終末細(xì)胞能表達(dá)胰島細(xì)胞特異性激素蛋白胰島素和C肽,見圖2。

        Figure 1 The expression of specific marker genes at different stages in islet cells圖1 胰島細(xì)胞標(biāo)志基因在誘導(dǎo)分化各階段的表達(dá)情況

        2.3 PCR-RFLP檢測印跡基因表達(dá)結(jié)果 印跡基因IGF2在分化終末的胰島樣細(xì)胞中呈雙等位基因表達(dá),見圖3。

        Figure 3 The expression of IGF2 at different stages圖3 分化前后細(xì)胞印跡基因表達(dá)情況

        3 討論

        ES細(xì)胞作為個(gè)體生長發(fā)育最早階段來源的細(xì)胞,其分化的整個(gè)過程其實(shí)就是表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)的過程,遺傳物質(zhì)不變,其表型卻可以有多種形式。環(huán)境因素、體外操作及內(nèi)分泌因素的變化也對IGF2的印跡及胎盤和胎兒的發(fā)育有一定的影響。IGF2/H19的表觀遺傳修飾在早期發(fā)育時(shí)也容易受到環(huán)境頻繁變化的影響,尤其是胚外組織[8]。應(yīng)用乙醇處理胎盤發(fā)現(xiàn),父系等位基因甲基化程度顯著低于生理鹽水處理的胎盤,提示外界因素對IGF2的印跡以及胎盤發(fā)育產(chǎn)生影響[9]。

        本研究中ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中應(yīng)用了Ac?tivin A和RA。Activin A是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)超家族的一種二硫化物穩(wěn)定蛋白,與細(xì)胞表面受體結(jié)合后誘導(dǎo)許多基因表達(dá),對限定性內(nèi)胚層的早期分化具有重要作用[10]。尤其胚胎干細(xì)胞在高濃度的Ac?tivin A培養(yǎng)作用下能大規(guī)模的向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞分化[11]。RA是神經(jīng)外胚層和中胚層前腸尾端化特征性的信號(hào)分子[12]。RA為胚胎發(fā)育和細(xì)胞功能維持所必需,參與誘導(dǎo)細(xì)胞分化和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。有研究表明,RA能夠調(diào)節(jié)胚胎內(nèi)胚層細(xì)胞分化,尤其是早期胰芽細(xì)胞的形成[14]。印跡基因IGF2的表達(dá)產(chǎn)物胰島素樣生長因子是一種胚胎生長因子,也是一種促有絲分裂肽,生理?xiàng)l件下對胚胎的正常生長發(fā)育有重要作用,病理?xiàng)l件下能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖。在嚙齒動(dòng)物中,IGF2的表達(dá)在出生后迅速下降,相當(dāng)于功能上的單倍體,即正常胎兒中只產(chǎn)生一個(gè)劑量的蛋白質(zhì);如果2個(gè)等位基因均不表達(dá),將表現(xiàn)為生長受限;相反,如果2個(gè)等位基因均出現(xiàn)表達(dá),必將產(chǎn)生2個(gè)劑量的蛋白質(zhì),導(dǎo)致胎兒過度生長,出生體質(zhì)量過重或產(chǎn)后生長速度過快[15]。本研究的雜交ES細(xì)胞系,在IGF2等位基因中存在特異性的限制性內(nèi)切酶多態(tài)位點(diǎn)。母源性表達(dá)的IGF2等位基因其RT-PCR產(chǎn)物可被酶解為321 bp及59 bp片段,父源性表達(dá)的IGF2等位基因則不被酶解。據(jù)此,酶解產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳即可區(qū)分出IGF2等位基因的表達(dá)情況。研究表明,IGF2印跡丟失與多種疾病有關(guān)[16]。

        筆者利用不同小鼠品系間等位基因限制性內(nèi)切酶多態(tài)性,對雜交而來的SF1-G細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞,收集分化前后細(xì)胞,通過PCR-RFLP檢測印跡基因IGF2表達(dá)親本來源,結(jié)果顯示,本來主要從父源單等位基因表達(dá)的印跡基因呈雙等位基因表達(dá),表現(xiàn)為印跡丟失狀態(tài)(LOT),其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果提示,在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞時(shí),要盡量保持其微環(huán)境的穩(wěn)定,避免引起表觀遺傳調(diào)控的異常,同時(shí)在應(yīng)用胚胎干細(xì)胞資源時(shí)要監(jiān)測其表觀遺傳的穩(wěn)定性。

        Figure 2 Immun of luorescence assay for detection of specific proteins in differentiated cells(×800)圖2 分化細(xì)胞免疫熒光染色檢測特異蛋白結(jié)果(×800)

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