劉 峰 湯佳珍 朱凌燕 甘華俠

胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)具有無限增殖和全能分化的潛力，理論上ES細胞具有分化為各種細胞的潛能[1]，目前已成功將ES細胞誘導分化為多種終末組織細胞，成為細胞和器官移植領(lǐng)域最具潛在優(yōu)勢的資源[2-3]?；蚪M印跡是指某些基因呈不遵從孟德爾定律依靠單親傳遞某些遺傳學性狀的現(xiàn)象，也就是某些基因呈親源依賴性單等位基因表達[4]，是目前表觀遺傳學研究的主要內(nèi)容之一。有研究顯示，體外長期培養(yǎng)的ES細胞，其表觀遺傳學呈現(xiàn)不穩(wěn)定趨勢[5]。經(jīng)體外受精（IVF）得到的ES細胞，存在基因組印跡異常[6]。鼠胰島素樣生長因子（IGF）2基因位于7號染色體上，是最早發(fā)現(xiàn)的印跡基因，胰腺的IGF2只從父本染色體表達。本研究旨在通過聚合酶鏈式反應-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)，檢測印跡基因IGF2在誘導分化細胞中的表達情況，探討體外誘導培養(yǎng)對基因組印跡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠ES細胞系由美國斯坦福大學Andrew.R.Hoffman惠贈。試劑：Knock-out DMEM、DMEM/F12、L-谷氨酰氨、胎牛血清（FBS）和TRIzol購自Invitrogen公司，白血病抑制因子（LIF）購自Chemicon公司，全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，RA）和尼克酰胺（nicotinamide，NIC）購自Sigma公司，N2添加物、B27添加物購自GIBCOBRL公司，Activin A購自Ramp;D公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq DNA聚合酶購自Fer?menta公司，限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，胰島素單克隆抗體購自abcam公司，C肽單克隆抗體購自Licon公司。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR檢測誘導分化后胰島細胞標志基因的表達情況 按常規(guī)法培養(yǎng)擴增ES細胞，參照Shi等[7]的三階段法誘導培養(yǎng)。分化各階段細胞總RNA按TRIzol說明書提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列及PCR的條件見表1。反應體系為10 μL，具體如下：10×緩沖液1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.8 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.2 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，引物（10 μmol/L，正反引物Mix）0.2 μL，cDNA模板(0.1 g/L)0.2 μL，ddH2O 7.6 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min后，94 ℃變性30 s，60℃（β-actin為58℃）退火30 s，72℃延伸30 s，完成30個循環(huán)，72℃5 min，瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下攝像觀察。

Table 1 The primer sequence of islet-specific genes表1 胰島細胞特異表達基因引物序列

1.2.2 免疫熒光染色 分化成熟的第3階段細胞，免疫熒光檢測胰島素及C肽，收集的分化細胞用PBS洗去細胞中的培養(yǎng)基，加4%的多聚甲醛溶液室溫下固定細胞；加一抗，室溫1 h或4℃過夜孵育，加磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3遍；孵育二抗，室溫孵育1 h；PBS洗4次，每次5～10 min，然后用5%BSA室溫封閉30 min；加DAPI（1∶1 000稀釋）染核，室溫避光孵育5 min，用PBS清洗2遍；將DAPI/Antifade Solution稀釋30倍，滴適量到蓋玻片上，室溫染色20 min；PBS洗3次，每次5 min；封片劑封片，37℃烤片10 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3 PCR-RFLP法分析誘導分化前后細胞印跡基因IGF2親本表達 以分化前后細胞cDNA為模板，用特異性引物擴增印跡基因 IGF2，引物序列：5＇-TGGCCCTCCTGGAGA?CRTACTGTGC-3＇，5＇-CTGTCCCTGCTCAAGAGGAGGTCA-3＇，PCR產(chǎn)物（380 bp）用特異的限制性內(nèi)切酶（BsaAI）；酶切產(chǎn)物（380、321、59 bp）在2%瓊脂糖凝膠進行電泳，溴乙錠染色，紫外投射儀上觀察電泳結(jié)果并攝像。

2 結(jié)果

2.1 誘導分化各階段細胞胰島細胞性標志物的表達情況 胰島素、胰高糖素、生長抑素、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2在未分化的ES細胞中不表達，在誘導分化第2階段末和第3階段末的細胞都有表達，且在第3階段比第2階段要強，見圖1。

2.2 最終分化細胞特異性蛋白表達 誘導分化終末細胞能表達胰島細胞特異性激素蛋白胰島素和C肽，見圖2。

Figure 1 The expression of specific marker genes at different stages in islet cells圖1 胰島細胞標志基因在誘導分化各階段的表達情況

2.3 PCR-RFLP檢測印跡基因表達結(jié)果 印跡基因IGF2在分化終末的胰島樣細胞中呈雙等位基因表達，見圖3。

Figure 3 The expression of IGF2 at different stages圖3 分化前后細胞印跡基因表達情況

3 討論

ES細胞作為個體生長發(fā)育最早階段來源的細胞，其分化的整個過程其實就是表觀遺傳調(diào)控基因表達的過程，遺傳物質(zhì)不變，其表型卻可以有多種形式。環(huán)境因素、體外操作及內(nèi)分泌因素的變化也對IGF2的印跡及胎盤和胎兒的發(fā)育有一定的影響。IGF2/H19的表觀遺傳修飾在早期發(fā)育時也容易受到環(huán)境頻繁變化的影響，尤其是胚外組織[8]。應用乙醇處理胎盤發(fā)現(xiàn)，父系等位基因甲基化程度顯著低于生理鹽水處理的胎盤，提示外界因素對IGF2的印跡以及胎盤發(fā)育產(chǎn)生影響[9]。

本研究中ES細胞誘導分化過程中應用了Ac?tivin A和RA。Activin A是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）超家族的一種二硫化物穩(wěn)定蛋白，與細胞表面受體結(jié)合后誘導許多基因表達，對限定性內(nèi)胚層的早期分化具有重要作用[10]。尤其胚胎干細胞在高濃度的Ac?tivin A培養(yǎng)作用下能大規(guī)模的向限定性內(nèi)胚層細胞分化[11]。RA是神經(jīng)外胚層和中胚層前腸尾端化特征性的信號分子[12]。RA為胚胎發(fā)育和細胞功能維持所必需，參與誘導細胞分化和促進細胞凋亡[13]。有研究表明，RA能夠調(diào)節(jié)胚胎內(nèi)胚層細胞分化，尤其是早期胰芽細胞的形成[14]。印跡基因IGF2的表達產(chǎn)物胰島素樣生長因子是一種胚胎生長因子，也是一種促有絲分裂肽，生理條件下對胚胎的正常生長發(fā)育有重要作用，病理條件下能刺激腫瘤細胞的增殖。在嚙齒動物中，IGF2的表達在出生后迅速下降，相當于功能上的單倍體，即正常胎兒中只產(chǎn)生一個劑量的蛋白質(zhì)；如果2個等位基因均不表達，將表現(xiàn)為生長受限；相反，如果2個等位基因均出現(xiàn)表達，必將產(chǎn)生2個劑量的蛋白質(zhì)，導致胎兒過度生長，出生體質(zhì)量過重或產(chǎn)后生長速度過快[15]。本研究的雜交ES細胞系，在IGF2等位基因中存在特異性的限制性內(nèi)切酶多態(tài)位點。母源性表達的IGF2等位基因其RT-PCR產(chǎn)物可被酶解為321 bp及59 bp片段，父源性表達的IGF2等位基因則不被酶解。據(jù)此，酶解產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳即可區(qū)分出IGF2等位基因的表達情況。研究表明，IGF2印跡丟失與多種疾病有關(guān)[16]。

筆者利用不同小鼠品系間等位基因限制性內(nèi)切酶多態(tài)性，對雜交而來的SF1-G細胞誘導分化為胰島樣細胞，收集分化前后細胞，通過PCR-RFLP檢測印跡基因IGF2表達親本來源，結(jié)果顯示，本來主要從父源單等位基因表達的印跡基因呈雙等位基因表達，表現(xiàn)為印跡丟失狀態(tài)（LOT），其機制有待進一步研究。本研究結(jié)果提示，在體外培養(yǎng)胚胎干細胞時，要盡量保持其微環(huán)境的穩(wěn)定，避免引起表觀遺傳調(diào)控的異常，同時在應用胚胎干細胞資源時要監(jiān)測其表觀遺傳的穩(wěn)定性。

Figure 2 Immun of luorescence assay for detection of specific proteins in differentiated cells（×800）圖2 分化細胞免疫熒光染色檢測特異蛋白結(jié)果（×800）

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