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        全反式維甲酸抑制IL-23/IL-17通路促進(jìn)小鼠移植皮膚存活的研究*

        2013-12-03 03:50:50徐三榮
        天津醫(yī)藥 2013年11期
        關(guān)鍵詞:受者移植物小劑量

        徐三榮 周 慶 韓 博 李 偉

        近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體的免疫系統(tǒng)中存在著一種新的CD4+T細(xì)胞亞群,以高水平分泌白細(xì)胞介素(IL)-17,并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子孤核受體(ROR)γt為主要特征,被命名為T(mén)h17細(xì)胞[1]。已證實(shí),Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,其分化和功能受IL-23的調(diào)控[2-3]。全反式維甲酸(ATRA)是維生素A的一種活性代謝產(chǎn)物,在抑制Th17細(xì)胞的分化和擴(kuò)增中發(fā)揮重要的作用[4]。本研究以小鼠皮膚移植為模型,探討ATRA對(duì)IL-23和IL-17表達(dá)的影響及機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。近交系、SPF級(jí)雄性Balb/c(H-2d)小鼠60只和DBA/2(H-2d)小鼠15只,6~8周齡,體質(zhì)量18~22 g,購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,自由攝食和飲水。(2)主要試劑及儀器。iCycler iQ實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)儀、GelDoc1000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司),ATRA(美國(guó)Sigma公司),總RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR反應(yīng)試劑盒(日本Ta?KaRa公司),IL-23和IL-17定量酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 以DBA/2小鼠為供者,Balb/c小鼠為受者,進(jìn)行背-背部皮膚移植。受者小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、小劑量組、大劑量組共3組,每組20只,術(shù)后5 d每組處死10只用于皮膚移植物和血液標(biāo)本收集及檢測(cè),另外10只用于術(shù)后生存分析。于移植前1 d至術(shù)后14 d或判定移植皮膚死亡之日,對(duì)照組每天以玉米油(0.25 mL)灌胃;小劑量組、大劑量組每天分別給予ATRA 10、30 mg/kg(溶解于玉米油)灌胃。

        1.2.2 皮膚移植 取DBA/2供者小鼠,腹腔注射5 g/L的戊巴比妥鈉麻醉,備皮、消毒后取直徑約1 cm的圓形背側(cè)全厚皮膚,刮除皮下脂肪及血管等組織,放于無(wú)菌生理鹽水中備用。Balb/c受者小鼠麻醉、備皮、消毒后,剪去左側(cè)胸腹交界處直徑約1 cm圓形皮膚。將供者皮膚覆蓋于受者創(chuàng)面上,用4-0絲線間斷縫合,醫(yī)用創(chuàng)可貼稍加壓包扎固定,5 d后去除敷料,以后觀察皮膚存活情況。50%以上結(jié)痂、壞死、變硬或脫落視為皮膚死亡。

        1.2.3 樣本的收集與制備 移植術(shù)后5 d,每組分別取10只小鼠,頸椎脫臼法處死,留取血液和皮膚移植物樣本。血液于室溫下靜置1 h,待其凝固,1 500×g離心10 min,吸取上清,-80℃下保存待用。皮膚組織部分浸泡于4%中性甲醛溶液用于病理切片,部分放入液氮中,并移至-80℃冰箱備用。

        1.2.4 檢測(cè)方法 (1)HE染色檢測(cè)皮膚移植物。取中性甲醛固定后的皮膚移植物,常規(guī)石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察。(2)ELISA測(cè)定血清IL-23、IL-17水平。室溫下充分解凍血清樣本,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,每個(gè)樣品均設(shè)2個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)終止后,用Biotek酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm光密度(OD)值。用Curve Expert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本OD值對(duì)應(yīng)的濃度。(3)Real-time PCR檢測(cè)皮膚移植物IL-23、RORγt和IL-17 mRNA表達(dá)。參照GenBank序列,應(yīng)用Primer Express 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列見(jiàn)表1,由上海生工生物工程有限公司合成。采用三步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序,反應(yīng)體系30 μL,預(yù)變性94℃5 min,PCR反應(yīng)94℃ 20 s,53℃ 30 s,72℃30 s,40個(gè)循環(huán)。根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線確定各樣品管中熒光強(qiáng)度增加到某一特定閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)。以目的基因與內(nèi)參基因(β-actin)Ct值的差值(△Ct)表示基因的相對(duì)表達(dá)水平,△Ct值越大,mRNA的相對(duì)表達(dá)水平越低。

        Table 1 Primer sequences表1 引物序列

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±ss)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用q檢驗(yàn),存活時(shí)間比較應(yīng)用Log-Rank法,相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān),Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組皮膚移植物存活時(shí)間 對(duì)照組、小劑量組和大劑量組皮膚移植物中位存活期分別為13、16、15.5 d,小劑量組、大劑量組高于對(duì)照組(χ2分別為16.900、9.915,均Plt;0.01),而小劑量組、大劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.054,P=0.817),見(jiàn)圖1。

        Figure 1 Survival curves of skin grafts in three group圖1 各組皮膚移植物的生存曲線

        2.2 各組皮膚移植物組織學(xué)觀察 移植術(shù)后5 d,HE染色顯示對(duì)照組皮膚有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),皮膚組織結(jié)構(gòu)分離,分級(jí)為Ⅱ級(jí);而小劑量組和大劑量組可見(jiàn)散在的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),皮膚層次結(jié)構(gòu)及附屬器形態(tài)完整,分級(jí)均為Ⅰ級(jí),見(jiàn)圖2。

        Figure 2 The histological examination of skin grafts on 5 days after transplantation(HE,×200)圖2 皮膚移植術(shù)后5 d組織病理學(xué)檢查(HE,×200)

        2.3 各組小鼠血清中IL-23、IL-17水平 皮膚移植術(shù)后5 d,小劑量組和大劑量組血清IL-23水平較對(duì)照組降低(Plt;0.05),而前2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)照組、小劑量組及大劑量組血清IL-17水平依次降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05),見(jiàn)表2。3組受者血清IL-23水平與IL-17水平呈正相關(guān)(r=0.712,Plt;0.01)。

        Table 2 Comparison of serum levels of IL-23 and IL-17 between three groups表2 各組血清中IL-23、IL-17水平比較(n=10,ng/L,x±s)

        2.4 各組受者皮膚移植物IL-23、RORγt和IL-17 mRNA表達(dá)水平 皮膚移植術(shù)后5 d,小劑量組、大劑量組IL-23、RORγt和IL-17 mRNA的表達(dá)水平均低于對(duì)照組(Plt;0.05),而大、小劑量組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表3。3組小鼠皮膚移植物IL-23與IL-17基因表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.515,Plt;0.05),RORγt與IL-23、IL-17基因表達(dá)水平亦呈正相關(guān)(r分別為0.430、0.417,均Plt;0.05)。

        Table 3 Relative expression levels of IL-23,RORγt and IL-17 mRNA in skin grafts between three groups表3 3組皮膚移植物中IL-23、RORγt和IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)水平(n=10,△CT,x±s)

        3 討論

        傳統(tǒng)認(rèn)為T(mén)h1/Th2途徑是移植排斥反應(yīng)發(fā)生的主要機(jī)制。而近來(lái)研究表明,Th17細(xì)胞也參與了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[5],其主要效應(yīng)因子是IL-17,IL-17具有強(qiáng)大的致炎性,主要是通過(guò)刺激基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β等促炎細(xì)胞因子,介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在急性炎癥部位聚集,從而誘導(dǎo)前炎癥反應(yīng)[6]。Gorbacheva等[7]通過(guò)將A/J小鼠心臟移植給IL-17基因敲除的Balb/c小鼠,研究表明IL-17在移植早期具有趨化效應(yīng)性T細(xì)胞到移植物中的作用,從而加大了移植炎癥反應(yīng)及組織損傷。而應(yīng)用IL-17R:IgG-Fc中和IL-17能使T細(xì)胞對(duì)異型抗原的增生反應(yīng)受到抑制,明顯減輕移植物的排異反應(yīng)[8]。IL-23是維持Th17細(xì)胞增殖和存活的重要細(xì)胞因子,屬于IL-12細(xì)胞因子超家族,是由IL-23p19亞基和IL-12p40亞基組成的異二聚體,主要由活化的抗原遞呈細(xì)胞分泌產(chǎn)生[9]。早期研究表明IL-23在Th17細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中起重要作用,但隨后的研究證實(shí)初始T細(xì)胞不表達(dá)IL-23R,因此,有研究認(rèn)為IL-23在初始T細(xì)胞向Th17分化早期不能發(fā)揮作用,但I(xiàn)L-23對(duì)Th17細(xì)胞后期的增殖存活以及功能的維持具有促進(jìn)作用[10-11]。熊俊杰等[12]在大鼠胰島移植中將IL-23R抗體注射到大鼠體內(nèi)阻斷IL-23R,有效降低了IL-17的表達(dá),且其抑制作用為劑量依賴性,表明IL-23對(duì)IL-17表達(dá)的促進(jìn)作用可以被IL-23R抗體抑制。ATRA目前被廣泛用于角化異常性皮膚病及急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療,其生物學(xué)效應(yīng)主要是通過(guò)核內(nèi)維甲酸受體(RAR)和維甲酸X受體(RXR)來(lái)介導(dǎo)。近年來(lái)有報(bào)道ATRA通過(guò)與RAR結(jié)合下調(diào)維甲酸相關(guān)RORγt的表達(dá)而抑制Th17細(xì)胞的分化[13],及通過(guò)減少I(mǎi)L-6R、IL-23R的表達(dá)而抑制Th17細(xì)胞的功能[4]。

        本研究以主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相同而次要淋巴細(xì)胞刺激抗原(MLS)不同的DBA(H-2d)與Balb/c(H-2d)小鼠建立皮膚移植模型,結(jié)果表明ATRA有效延緩皮膚移植排斥反應(yīng)的機(jī)制可能與降低IL-23、RORγt和IL-17的mRNA表達(dá),從而抑制IL-23與IL-17的分泌有關(guān)。相關(guān)性分析表明IL-23對(duì)IL-17的分泌可能有促進(jìn)作用,而其作用可以被ATRA阻斷。雖然隨著ATRA劑量的增大,對(duì)IL-17蛋白分泌的抑制作用也顯著增強(qiáng),且皮膚移植物存活時(shí)間并沒(méi)有相應(yīng)的延長(zhǎng),可能原因是ATRA對(duì)抗炎癥反應(yīng)復(fù)雜,并不僅僅依賴對(duì)Th17細(xì)胞的抑制,而是Th1/Th17、Th1/Th2和Tregs/Th17平衡等機(jī)制共同作用的結(jié)果,在以后的研究中將進(jìn)一步探討其機(jī)制。

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