徐 霞 李 睿 任 嬙 劉 芳 宋麗秀 鄭 勇 陳衛(wèi)剛△

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）被稱為繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號(hào)分子，它具有多種生理功能，尤其在肝纖維化中作用明顯[1]。研究顯示，內(nèi)源性或外源性H2S能以多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡，其作用與H2S的劑量和信號(hào)途徑有關(guān)[2]。最近研究表明，H2S對(duì)肝纖維化及門脈高壓的發(fā)生發(fā)展起重要的保護(hù)作用[3]。本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)肝星狀細(xì)胞（hepat?ic stellate cell，HSC）凋亡情況，并用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)，初步探討H2S在P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）阻斷劑SB203580影響HSC增殖、凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠HSC-T6細(xì)胞株購自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室；NaHS（美國Sigma公司）；SB203580（德國Merck公司）；DMEM（高糖）培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA（美國HyClone公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Amersco公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司），瓊脂糖（Spanish公司），TRIzol（美國Invitrogen公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Sigma公司），Annexin V-FITC試劑盒（美國Biovision公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HSC-T6選用100 mL/L FBS DMEM（高糖）培養(yǎng)基，按1.5×105個(gè)/mL接種，37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)，8 h常規(guī)貼壁，1～2 d換液，4～7 d后細(xì)胞鋪滿瓶底70%～90%傳代，傳代周期穩(wěn)定即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；DMSO組：對(duì)照組基礎(chǔ)上加DMSO，使DMSO終濃度為0.1%；NaHS組：對(duì)照組基礎(chǔ)上加NaHS（H2S供體）至最適濃度；SB組：DMSO組基礎(chǔ)上加SB203580至最適濃度；SB+NaHS組：SB組基礎(chǔ)上加NaHS至最適濃度。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 在無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種傳代的HSC，每組6復(fù)孔，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104個(gè)/mL，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞生長至80%以上融合度時(shí)，用無血清培養(yǎng)基同步化處理12 h。NaHS組分別按照25、50、75、100、200 μmol/L濃度梯度給藥，SB組分別按照10、25、50、75、100 μmol/L濃度梯度給藥，確定最適濃度。在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后，除邊緣孔外每孔均加入5 g·L-1的MTT 20 μL。反應(yīng)4 h后用1 mL注射器吸去培養(yǎng)基，并加150 μL DMSO，反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度（A）值，測(cè)定波長570 nm，參考波長630 nm，計(jì)算A值=A570-A630，以消除非特異性光吸收效應(yīng)。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（IR），IR=（1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A）×100%。

1.2.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將傳代的HSC接種于6孔培養(yǎng)板中，在細(xì)胞生長至80%以上融合度后，吸去原培養(yǎng)基，換為無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h，按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)濃度的NaHS和SB203580，加樣后的各組細(xì)胞繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后開始取樣，取樣方法：每孔用PBS洗2遍，各加300 μL胰酶消化，持續(xù)吹打使其分散，PBS離心（1 000 r/min離心5 min）洗滌2次，加入binding buffer和Annexin V-FITC/PI雙染色劑，4℃避光30 min后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá) 應(yīng)用TRIzol試劑按說明書提取HSC總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的純度及濃度。A260/A280≥1.8說明RNA純度較高。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性，-80℃保存待用。（1）cDNA第一鏈合成：逆轉(zhuǎn)錄使用RevertAidTMH minus First Strand cDNA Synthesis Kit，按照說明書方法進(jìn)行。（2）逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，其中cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR Master Mix(2×)12.5 μL，DEPC水定容至25 μL。設(shè)計(jì)引物，Ⅰ型膠原引物序列：正義5′-GGTCCCAAAGGTGCTGATGG-3′，反 義 5′-GACCAGCCT?CACCACGGTCT-3′；Ⅲ型膠原引物序列：正義5′-CGAGGT?GACAGAGGTGAAAGA-3′，反義 5′-AACCCAGTATTCTCC?GCTCTT-3′；GAPDH引物序列：正義5′-CAAGGTCATCCAT?GACAACTTTG-3′，反義5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR擴(kuò)增條件為：Ⅰ型膠原95 ℃ 5min，95℃ 30 s，58 ℃30 s，72℃ 30 s，共37個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min；Ⅲ型膠原95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。（3）PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，采用Quantity one 4.6.2凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算各個(gè)條帶的A值，以各樣本蛋白與GAPDH的比值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±ss表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANO?VA），組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaHS對(duì)SB203580影響HSC增殖的作用 50 μmol/L NaHS組的A值高于對(duì)照組（P＜0.05），其余NaHS組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同藥物濃度SB組的A值均低于對(duì)照組（P＜0.05），但因低濃度SB203580無明顯抑制HSC增殖，而高濃度SB抑制率較大且影響細(xì)胞形態(tài)，故75 μmol/L SB為最適濃度，見表1。倒置顯微鏡下觀察NaHS組細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，細(xì)胞形態(tài)未見改變，而SB組細(xì)胞內(nèi)可見較多空泡狀及凋亡細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量無明顯增多，見圖1。

Table 1 Comparison of cell proliferation of HSC-T6 between groups表1 各組HSC-T6細(xì)胞增殖情況的比較

2.2 SB203580和NaHS對(duì)HSC-T6凋亡的影響 從FITC和PI熒光雙參數(shù)點(diǎn)圖觀察到，對(duì)照組HSC-T6主要分布在左下象限，因操作等原因引起的機(jī)械性死亡細(xì)胞數(shù)量非常少（＜2%），見圖2。SB組、SB+NaHS組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，且SB+NaHS組高于SB組（均P＜0.05）；DMSO組、NaHS組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Table 2 Comparison of apoptotic rates in HSC T6 between five groups表2 各組HSC-T6凋亡率的比較

2.3 SB203580和NaHS對(duì)HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA水平的影響 HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在各組中均表達(dá)，其中NaHS組表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05），且表達(dá)量最多，條帶最亮、最寬，SB組與SB+NaHS組表達(dá)低于對(duì)照組和NaHS組（P＜0.05），表達(dá)量較少，條帶較暗，見表3、圖3。

Table 3 The expressions of COL-Ⅰand COL-ⅢmRNA in HSC T6 between five groups表3 各組HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)

3 討論

HSC活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，活化后的HSC是肝內(nèi)膠原及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的主要來源。肝臟受損時(shí)HSC被激活，分泌大量ECM，并表達(dá)Ⅰ、Ⅲ型膠原等促纖維化因子。H2S作為一種新型內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，存在于人體多個(gè)系統(tǒng)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。課題組前期研究結(jié)果表明H2S能夠促進(jìn)肝硬化大鼠肝組織內(nèi)某種細(xì)胞的增殖，減少肝細(xì)胞損傷[4]；外源性H2S可使抗凋亡分子survivin蛋白及基因表達(dá)上調(diào)，從而減少肝細(xì)胞凋亡[5]；肝硬化大鼠給予H2S代謝酶抑制劑后門靜脈壓力升高[2]，提示H2S在肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中及調(diào)節(jié)門靜脈壓力方面起重要保護(hù)作用。

Figure 3 The expressions of COL-Ⅰand COL-ⅢmRNA in HSC T6 detected by RT-PCR assay圖3 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)

P38MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。Keuling等[6]用SB203580特異性阻斷P38MAPK通路能夠增強(qiáng)ABT-737誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞凋亡。有研究者發(fā)現(xiàn)P38MAPK不僅參與調(diào)節(jié)α1（Ⅰ）型膠原mRNA表達(dá)，而且增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性[7]。Schnabl等[8]用從大鼠分離的HSC分別用表達(dá)TAK1的腺病毒載體、JNK特異性阻斷劑阻斷JNK通路，P38MAPK特異性阻斷劑阻斷P38MAPK信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)阻斷P38MAPK后可使α1（Ⅰ）型膠原mRNA的表達(dá)降低，但使HSC增殖較明顯，而JNK信號(hào)通路一定程度上調(diào)控了HSC激活、生長調(diào)節(jié)及膠原的合成。Anania等[9]研究證實(shí)阻斷JNK活性后可抑制HSC內(nèi)α2（Ⅰ）型膠原的表達(dá)。由此本課題組推測(cè)H2S可能通過P38MAPK信號(hào)通路對(duì)HSC起作用，從而對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)有影響。

在涉及多種細(xì)胞的凋亡反應(yīng)中核因子-κB（nu?clear factor kappa B，NF-κB）是HSC最重要的抗凋亡因子，抑制NF-κB能夠影響HSC的激活，許多研究證實(shí)它在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[10]。Schwabe等[11]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB不但能夠抑制肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制HSC凋亡，還可促進(jìn)其增殖。沈欽海等[12]證實(shí)外源性硫化氫可抑制NF-κB表達(dá)，促進(jìn)激活的HSC凋亡。由于NF-κB可直接參與調(diào)節(jié)膠原蛋白的表達(dá)[13]，故抑制其活性可能具有直接減少ECM合成的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予P38MAPK阻斷劑SB203580，H2S刺激的HSC凋亡率明顯高于僅給予通路抑制劑組，提示H2S可能與P38MAPK信號(hào)通路有關(guān)，將SB203580與NaHS（H2S）同時(shí)作用于HSC時(shí)，或許引起兩藥物發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)，使H2S增加了SB203580的藥物敏感性，從而促進(jìn)凋亡。當(dāng)外源性給予H2S供體NaHS后，阻斷P38MAPK可使HSC內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)明顯降低，未給予抑制劑的NaHS可促進(jìn)HSC增殖，增加Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)，此結(jié)果與Schnabl等[8]研究結(jié)果相似，證實(shí)了H2S通過P38MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)HSC內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)。推測(cè)H2S通過激活P38MAPK信號(hào)通路作用于HSC，HSC活化伴隨NF-κB激活，活化的NF-κB通過抑制肝細(xì)胞凋亡且促進(jìn)HSC增殖，引起ECM增多，膠原是ECM的最主要成分，從而引起Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增高。由于課題組前期研究結(jié)果已證實(shí)H2S對(duì)肝纖維化具有保護(hù)作用，膠原蛋白的最終表達(dá)才能對(duì)肝纖維化起明顯指示作用，那么翻譯過程中是否由于某種機(jī)制使高表達(dá)的mRNA翻譯為低表達(dá)的蛋白質(zhì)而使膠原產(chǎn)生減少，從而起到抗肝纖維化作用；且本實(shí)驗(yàn)僅研究H2S對(duì)HSC的作用，H2S對(duì)肝細(xì)胞是否也能夠促增殖產(chǎn)生膠原使其高表達(dá)，其具體作用機(jī)制還尚未可知。在此需要注意的是，上述研究結(jié)果提示阻斷P38MAPK信號(hào)通路可以明顯抑制H2S刺激的HSC增殖，促進(jìn)其凋亡，這與Schnabl等[8]的研究結(jié)果又有所不同，考慮可能與如下原因有關(guān)：MAPK信號(hào)通路包括P38、ERK和JNK等，本實(shí)驗(yàn)僅用SB203580阻斷P38MAPK信號(hào)通路，這是否是由于P38MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)通路產(chǎn)生交叉反應(yīng)，又或者M(jìn)APK信號(hào)通路各分支間存在協(xié)同或干擾效應(yīng)，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

Figure 1 Changes in cell morphology under inverted microscope(×200)圖1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化（×200）

Figure 2 Comparison of apoptotic rates in HSC T6 cells between groups圖2 各組HSC-T6細(xì)胞凋亡率的比較

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