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        硫化氫在SB203580影響肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡中的作用*

        2013-12-03 03:50:50宋麗秀陳衛(wèi)剛
        天津醫(yī)藥 2013年11期
        關(guān)鍵詞:硫化氫膠原纖維化

        徐 霞 李 睿 任 嬙 劉 芳 宋麗秀 鄭 勇 陳衛(wèi)剛△

        硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)被稱為繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號(hào)分子,它具有多種生理功能,尤其在肝纖維化中作用明顯[1]。研究顯示,內(nèi)源性或外源性H2S能以多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡,其作用與H2S的劑量和信號(hào)途徑有關(guān)[2]。最近研究表明,H2S對(duì)肝纖維化及門脈高壓的發(fā)生發(fā)展起重要的保護(hù)作用[3]。本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)肝星狀細(xì)胞(hepat?ic stellate cell,HSC)凋亡情況,并用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá),初步探討H2S在P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)阻斷劑SB203580影響HSC增殖、凋亡中的作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料 大鼠HSC-T6細(xì)胞株購自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室;NaHS(美國Sigma公司);SB203580(德國Merck公司);DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA(美國HyClone公司),二甲基亞砜(DMSO,美國Amersco公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司),瓊脂糖(Spanish公司),TRIzol(美國Invitrogen公司),四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國Sigma公司),Annexin V-FITC試劑盒(美國Biovision公司),流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HSC-T6選用100 mL/L FBS DMEM(高糖)培養(yǎng)基,按1.5×105個(gè)/mL接種,37 ℃、5%CO2中培養(yǎng),8 h常規(guī)貼壁,1~2 d換液,4~7 d后細(xì)胞鋪滿瓶底70%~90%傳代,傳代周期穩(wěn)定即可用于實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組:10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;DMSO組:對(duì)照組基礎(chǔ)上加DMSO,使DMSO終濃度為0.1%;NaHS組:對(duì)照組基礎(chǔ)上加NaHS(H2S供體)至最適濃度;SB組:DMSO組基礎(chǔ)上加SB203580至最適濃度;SB+NaHS組:SB組基礎(chǔ)上加NaHS至最適濃度。

        1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 在無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種傳代的HSC,每組6復(fù)孔,調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104個(gè)/mL,每孔加入200 μL細(xì)胞懸液,當(dāng)細(xì)胞生長至80%以上融合度時(shí),用無血清培養(yǎng)基同步化處理12 h。NaHS組分別按照25、50、75、100、200 μmol/L濃度梯度給藥,SB組分別按照10、25、50、75、100 μmol/L濃度梯度給藥,確定最適濃度。在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后,除邊緣孔外每孔均加入5 g·L-1的MTT 20 μL。反應(yīng)4 h后用1 mL注射器吸去培養(yǎng)基,并加150 μL DMSO,反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度(A)值,測(cè)定波長570 nm,參考波長630 nm,計(jì)算A值=A570-A630,以消除非特異性光吸收效應(yīng)。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR),IR=(1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%。

        1.2.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將傳代的HSC接種于6孔培養(yǎng)板中,在細(xì)胞生長至80%以上融合度后,吸去原培養(yǎng)基,換為無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h,按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)濃度的NaHS和SB203580,加樣后的各組細(xì)胞繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后開始取樣,取樣方法:每孔用PBS洗2遍,各加300 μL胰酶消化,持續(xù)吹打使其分散,PBS離心(1 000 r/min離心5 min)洗滌2次,加入binding buffer和Annexin V-FITC/PI雙染色劑,4℃避光30 min后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

        1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá) 應(yīng)用TRIzol試劑按說明書提取HSC總RNA,用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的純度及濃度。A260/A280≥1.8說明RNA純度較高。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性,-80℃保存待用。(1)cDNA第一鏈合成:逆轉(zhuǎn)錄使用RevertAidTMH minus First Strand cDNA Synthesis Kit,按照說明書方法進(jìn)行。(2)逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL,其中cDNA 2 μL,上下游引物各0.5 μL,PCR Master Mix(2×)12.5 μL,DEPC水定容至25 μL。設(shè)計(jì)引物,Ⅰ型膠原引物序列:正義5′-GGTCCCAAAGGTGCTGATGG-3′,反 義 5′-GACCAGCCT?CACCACGGTCT-3′;Ⅲ型膠原引物序列:正義5′-CGAGGT?GACAGAGGTGAAAGA-3′,反義 5′-AACCCAGTATTCTCC?GCTCTT-3′;GAPDH引物序列:正義5′-CAAGGTCATCCAT?GACAACTTTG-3′,反義5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR擴(kuò)增條件為:Ⅰ型膠原95 ℃ 5min,95℃ 30 s,58 ℃30 s,72℃ 30 s,共37個(gè)循環(huán),72℃延伸 10 min;Ⅲ型膠原95℃ 5 min,95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共36個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。(3)PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析,采用Quantity one 4.6.2凝膠成像分析系統(tǒng)計(jì)算各個(gè)條帶的A值,以各樣本蛋白與GAPDH的比值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以±ss表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANO?VA),組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 NaHS對(duì)SB203580影響HSC增殖的作用 50 μmol/L NaHS組的A值高于對(duì)照組(P<0.05),其余NaHS組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同藥物濃度SB組的A值均低于對(duì)照組(P<0.05),但因低濃度SB203580無明顯抑制HSC增殖,而高濃度SB抑制率較大且影響細(xì)胞形態(tài),故75 μmol/L SB為最適濃度,見表1。倒置顯微鏡下觀察NaHS組細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多,細(xì)胞形態(tài)未見改變,而SB組細(xì)胞內(nèi)可見較多空泡狀及凋亡細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)量無明顯增多,見圖1。

        Table 1 Comparison of cell proliferation of HSC-T6 between groups表1 各組HSC-T6細(xì)胞增殖情況的比較

        2.2 SB203580和NaHS對(duì)HSC-T6凋亡的影響 從FITC和PI熒光雙參數(shù)點(diǎn)圖觀察到,對(duì)照組HSC-T6主要分布在左下象限,因操作等原因引起的機(jī)械性死亡細(xì)胞數(shù)量非常少(<2%),見圖2。SB組、SB+NaHS組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組,且SB+NaHS組高于SB組(均P<0.05);DMSO組、NaHS組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。

        Table 2 Comparison of apoptotic rates in HSC T6 between five groups表2 各組HSC-T6凋亡率的比較

        2.3 SB203580和NaHS對(duì)HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA水平的影響 HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在各組中均表達(dá),其中NaHS組表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05),且表達(dá)量最多,條帶最亮、最寬,SB組與SB+NaHS組表達(dá)低于對(duì)照組和NaHS組(P<0.05),表達(dá)量較少,條帶較暗,見表3、圖3。

        Table 3 The expressions of COL-Ⅰand COL-ⅢmRNA in HSC T6 between five groups表3 各組HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)

        3 討論

        HSC活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié),活化后的HSC是肝內(nèi)膠原及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的主要來源。肝臟受損時(shí)HSC被激活,分泌大量ECM,并表達(dá)Ⅰ、Ⅲ型膠原等促纖維化因子。H2S作為一種新型內(nèi)源性氣體信號(hào)分子,存在于人體多個(gè)系統(tǒng),具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。課題組前期研究結(jié)果表明H2S能夠促進(jìn)肝硬化大鼠肝組織內(nèi)某種細(xì)胞的增殖,減少肝細(xì)胞損傷[4];外源性H2S可使抗凋亡分子survivin蛋白及基因表達(dá)上調(diào),從而減少肝細(xì)胞凋亡[5];肝硬化大鼠給予H2S代謝酶抑制劑后門靜脈壓力升高[2],提示H2S在肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中及調(diào)節(jié)門靜脈壓力方面起重要保護(hù)作用。

        Figure 3 The expressions of COL-Ⅰand COL-ⅢmRNA in HSC T6 detected by RT-PCR assay圖3 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)

        P38MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。Keuling等[6]用SB203580特異性阻斷P38MAPK通路能夠增強(qiáng)ABT-737誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞凋亡。有研究者發(fā)現(xiàn)P38MAPK不僅參與調(diào)節(jié)α1(Ⅰ)型膠原mRNA表達(dá),而且增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性[7]。Schnabl等[8]用從大鼠分離的HSC分別用表達(dá)TAK1的腺病毒載體、JNK特異性阻斷劑阻斷JNK通路,P38MAPK特異性阻斷劑阻斷P38MAPK信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)阻斷P38MAPK后可使α1(Ⅰ)型膠原mRNA的表達(dá)降低,但使HSC增殖較明顯,而JNK信號(hào)通路一定程度上調(diào)控了HSC激活、生長調(diào)節(jié)及膠原的合成。Anania等[9]研究證實(shí)阻斷JNK活性后可抑制HSC內(nèi)α2(Ⅰ)型膠原的表達(dá)。由此本課題組推測(cè)H2S可能通過P38MAPK信號(hào)通路對(duì)HSC起作用,從而對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)有影響。

        在涉及多種細(xì)胞的凋亡反應(yīng)中核因子-κB(nu?clear factor kappa B,NF-κB)是HSC最重要的抗凋亡因子,抑制NF-κB能夠影響HSC的激活,許多研究證實(shí)它在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[10]。Schwabe等[11]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB不但能夠抑制肝細(xì)胞凋亡,同時(shí)抑制HSC凋亡,還可促進(jìn)其增殖。沈欽海等[12]證實(shí)外源性硫化氫可抑制NF-κB表達(dá),促進(jìn)激活的HSC凋亡。由于NF-κB可直接參與調(diào)節(jié)膠原蛋白的表達(dá)[13],故抑制其活性可能具有直接減少ECM合成的作用。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予P38MAPK阻斷劑SB203580,H2S刺激的HSC凋亡率明顯高于僅給予通路抑制劑組,提示H2S可能與P38MAPK信號(hào)通路有關(guān),將SB203580與NaHS(H2S)同時(shí)作用于HSC時(shí),或許引起兩藥物發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng),使H2S增加了SB203580的藥物敏感性,從而促進(jìn)凋亡。當(dāng)外源性給予H2S供體NaHS后,阻斷P38MAPK可使HSC內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)明顯降低,未給予抑制劑的NaHS可促進(jìn)HSC增殖,增加Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá),此結(jié)果與Schnabl等[8]研究結(jié)果相似,證實(shí)了H2S通過P38MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)HSC內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)。推測(cè)H2S通過激活P38MAPK信號(hào)通路作用于HSC,HSC活化伴隨NF-κB激活,活化的NF-κB通過抑制肝細(xì)胞凋亡且促進(jìn)HSC增殖,引起ECM增多,膠原是ECM的最主要成分,從而引起Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增高。由于課題組前期研究結(jié)果已證實(shí)H2S對(duì)肝纖維化具有保護(hù)作用,膠原蛋白的最終表達(dá)才能對(duì)肝纖維化起明顯指示作用,那么翻譯過程中是否由于某種機(jī)制使高表達(dá)的mRNA翻譯為低表達(dá)的蛋白質(zhì)而使膠原產(chǎn)生減少,從而起到抗肝纖維化作用;且本實(shí)驗(yàn)僅研究H2S對(duì)HSC的作用,H2S對(duì)肝細(xì)胞是否也能夠促增殖產(chǎn)生膠原使其高表達(dá),其具體作用機(jī)制還尚未可知。在此需要注意的是,上述研究結(jié)果提示阻斷P38MAPK信號(hào)通路可以明顯抑制H2S刺激的HSC增殖,促進(jìn)其凋亡,這與Schnabl等[8]的研究結(jié)果又有所不同,考慮可能與如下原因有關(guān):MAPK信號(hào)通路包括P38、ERK和JNK等,本實(shí)驗(yàn)僅用SB203580阻斷P38MAPK信號(hào)通路,這是否是由于P38MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)通路產(chǎn)生交叉反應(yīng),又或者M(jìn)APK信號(hào)通路各分支間存在協(xié)同或干擾效應(yīng),具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

        Figure 1 Changes in cell morphology under inverted microscope(×200)圖1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(×200)

        Figure 2 Comparison of apoptotic rates in HSC T6 cells between groups圖2 各組HSC-T6細(xì)胞凋亡率的比較

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