徐 霞 李 睿 任 嬙 劉 芳 宋麗秀 鄭 勇 陳衛(wèi)剛△
硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)被稱為繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子,它具有多種生理功能,尤其在肝纖維化中作用明顯[1]。研究顯示,內源性或外源性H2S能以多種方式調節(jié)細胞的增殖與凋亡,其作用與H2S的劑量和信號途徑有關[2]。最近研究表明,H2S對肝纖維化及門脈高壓的發(fā)生發(fā)展起重要的保護作用[3]。本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(FCM)檢測肝星狀細胞(hepat?ic stellate cell,HSC)凋亡情況,并用逆轉錄聚合酶鏈反應(PCR)法檢測HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達,初步探討H2S在P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)阻斷劑SB203580影響HSC增殖、凋亡中的作用。
1.1 材料 大鼠HSC-T6細胞株購自中南大學湘雅中心實驗室;NaHS(美國Sigma公司);SB203580(德國Merck公司);DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA(美國HyClone公司),二甲基亞砜(DMSO,美國Amersco公司),逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司),瓊脂糖(Spanish公司),TRIzol(美國Invitrogen公司),四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國Sigma公司),Annexin V-FITC試劑盒(美國Biovision公司),流式細胞儀(美國BD公司)。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) HSC-T6選用100 mL/L FBS DMEM(高糖)培養(yǎng)基,按1.5×105個/mL接種,37 ℃、5%CO2中培養(yǎng),8 h常規(guī)貼壁,1~2 d換液,4~7 d后細胞鋪滿瓶底70%~90%傳代,傳代周期穩(wěn)定即可用于實驗。
1.2.2 實驗分組 對照組:10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;DMSO組:對照組基礎上加DMSO,使DMSO終濃度為0.1%;NaHS組:對照組基礎上加NaHS(H2S供體)至最適濃度;SB組:DMSO組基礎上加SB203580至最適濃度;SB+NaHS組:SB組基礎上加NaHS至最適濃度。
1.2.3 MTT法檢測細胞增殖 在無菌96孔細胞培養(yǎng)板中接種傳代的HSC,每組6復孔,調整細胞濃度為6×104個/mL,每孔加入200 μL細胞懸液,當細胞生長至80%以上融合度時,用無血清培養(yǎng)基同步化處理12 h。NaHS組分別按照25、50、75、100、200 μmol/L濃度梯度給藥,SB組分別按照10、25、50、75、100 μmol/L濃度梯度給藥,確定最適濃度。在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后,除邊緣孔外每孔均加入5 g·L-1的MTT 20 μL。反應4 h后用1 mL注射器吸去培養(yǎng)基,并加150 μL DMSO,反應30 min后用酶標儀測定其吸光度(A)值,測定波長570 nm,參考波長630 nm,計算A值=A570-A630,以消除非特異性光吸收效應。計算細胞增殖抑制率(IR),IR=(1-實驗組A/對照組A)×100%。
1.2.4 FCM檢測細胞凋亡 將傳代的HSC接種于6孔培養(yǎng)板中,在細胞生長至80%以上融合度后,吸去原培養(yǎng)基,換為無血清培養(yǎng)基同步化處理24 h,按照實驗分組分別加入相應濃度的NaHS和SB203580,加樣后的各組細胞繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后開始取樣,取樣方法:每孔用PBS洗2遍,各加300 μL胰酶消化,持續(xù)吹打使其分散,PBS離心(1 000 r/min離心5 min)洗滌2次,加入binding buffer和Annexin V-FITC/PI雙染色劑,4℃避光30 min后上機檢測細胞凋亡率。
1.2.5 逆轉錄PCR法測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達 應用TRIzol試劑按說明書提取HSC總RNA,用紫外分光光度儀測定總RNA的純度及濃度。A260/A280≥1.8說明RNA純度較高。瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性,-80℃保存待用。(1)cDNA第一鏈合成:逆轉錄使用RevertAidTMH minus First Strand cDNA Synthesis Kit,按照說明書方法進行。(2)逆轉錄PCR反應。PCR擴增反應體系為25 μL,其中cDNA 2 μL,上下游引物各0.5 μL,PCR Master Mix(2×)12.5 μL,DEPC水定容至25 μL。設計引物,Ⅰ型膠原引物序列:正義5′-GGTCCCAAAGGTGCTGATGG-3′,反 義 5′-GACCAGCCT?CACCACGGTCT-3′;Ⅲ型膠原引物序列:正義5′-CGAGGT?GACAGAGGTGAAAGA-3′,反義 5′-AACCCAGTATTCTCC?GCTCTT-3′;GAPDH引物序列:正義5′-CAAGGTCATCCAT?GACAACTTTG-3′,反義5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR擴增條件為:Ⅰ型膠原95 ℃ 5min,95℃ 30 s,58 ℃30 s,72℃ 30 s,共37個循環(huán),72℃延伸 10 min;Ⅲ型膠原95℃ 5 min,95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共36個循環(huán),72℃延伸10 min。(3)PCR產物用20 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳分析,采用Quantity one 4.6.2凝膠成像分析系統(tǒng)計算各個條帶的A值,以各樣本蛋白與GAPDH的比值表示mRNA的相對表達水平。
1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以±ss表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANO?VA),組間多重比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 NaHS對SB203580影響HSC增殖的作用 50 μmol/L NaHS組的A值高于對照組(P<0.05),其余NaHS組與對照組差異無統(tǒng)計學意義;不同藥物濃度SB組的A值均低于對照組(P<0.05),但因低濃度SB203580無明顯抑制HSC增殖,而高濃度SB抑制率較大且影響細胞形態(tài),故75 μmol/L SB為最適濃度,見表1。倒置顯微鏡下觀察NaHS組細胞較對照組明顯增多,細胞形態(tài)未見改變,而SB組細胞內可見較多空泡狀及凋亡細胞,細胞數(shù)量無明顯增多,見圖1。
Table 1 Comparison of cell proliferation of HSC-T6 between groups表1 各組HSC-T6細胞增殖情況的比較
2.2 SB203580和NaHS對HSC-T6凋亡的影響 從FITC和PI熒光雙參數(shù)點圖觀察到,對照組HSC-T6主要分布在左下象限,因操作等原因引起的機械性死亡細胞數(shù)量非常少(<2%),見圖2。SB組、SB+NaHS組細胞凋亡率高于對照組,且SB+NaHS組高于SB組(均P<0.05);DMSO組、NaHS組與對照組差異無統(tǒng)計學意義,見表2。
Table 2 Comparison of apoptotic rates in HSC T6 between five groups表2 各組HSC-T6凋亡率的比較
2.3 SB203580和NaHS對HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA水平的影響 HSC-T6中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA在各組中均表達,其中NaHS組表達高于對照組(P<0.05),且表達量最多,條帶最亮、最寬,SB組與SB+NaHS組表達低于對照組和NaHS組(P<0.05),表達量較少,條帶較暗,見表3、圖3。
Table 3 The expressions of COL-Ⅰand COL-ⅢmRNA in HSC T6 between five groups表3 各組HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達
HSC活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié),活化后的HSC是肝內膠原及細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的主要來源。肝臟受損時HSC被激活,分泌大量ECM,并表達Ⅰ、Ⅲ型膠原等促纖維化因子。H2S作為一種新型內源性氣體信號分子,存在于人體多個系統(tǒng),具有廣泛的生物學效應。課題組前期研究結果表明H2S能夠促進肝硬化大鼠肝組織內某種細胞的增殖,減少肝細胞損傷[4];外源性H2S可使抗凋亡分子survivin蛋白及基因表達上調,從而減少肝細胞凋亡[5];肝硬化大鼠給予H2S代謝酶抑制劑后門靜脈壓力升高[2],提示H2S在肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中及調節(jié)門靜脈壓力方面起重要保護作用。
Figure 3 The expressions of COL-Ⅰand COL-ⅢmRNA in HSC T6 detected by RT-PCR assay圖3 逆轉錄PCR檢測HSC-T6Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達
P38MAPK信號通路與細胞增殖、凋亡等多種生物學行為密切相關。Keuling等[6]用SB203580特異性阻斷P38MAPK通路能夠增強ABT-737誘導的黑色素瘤細胞凋亡。有研究者發(fā)現(xiàn)P38MAPK不僅參與調節(jié)α1(Ⅰ)型膠原mRNA表達,而且增強mRNA穩(wěn)定性[7]。Schnabl等[8]用從大鼠分離的HSC分別用表達TAK1的腺病毒載體、JNK特異性阻斷劑阻斷JNK通路,P38MAPK特異性阻斷劑阻斷P38MAPK信號通路,發(fā)現(xiàn)阻斷P38MAPK后可使α1(Ⅰ)型膠原mRNA的表達降低,但使HSC增殖較明顯,而JNK信號通路一定程度上調控了HSC激活、生長調節(jié)及膠原的合成。Anania等[9]研究證實阻斷JNK活性后可抑制HSC內α2(Ⅰ)型膠原的表達。由此本課題組推測H2S可能通過P38MAPK信號通路對HSC起作用,從而對Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達有影響。
在涉及多種細胞的凋亡反應中核因子-κB(nu?clear factor kappa B,NF-κB)是HSC最重要的抗凋亡因子,抑制NF-κB能夠影響HSC的激活,許多研究證實它在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[10]。Schwabe等[11]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB不但能夠抑制肝細胞凋亡,同時抑制HSC凋亡,還可促進其增殖。沈欽海等[12]證實外源性硫化氫可抑制NF-κB表達,促進激活的HSC凋亡。由于NF-κB可直接參與調節(jié)膠原蛋白的表達[13],故抑制其活性可能具有直接減少ECM合成的作用。
本實驗結果顯示,給予P38MAPK阻斷劑SB203580,H2S刺激的HSC凋亡率明顯高于僅給予通路抑制劑組,提示H2S可能與P38MAPK信號通路有關,將SB203580與NaHS(H2S)同時作用于HSC時,或許引起兩藥物發(fā)生某種化學反應,使H2S增加了SB203580的藥物敏感性,從而促進凋亡。當外源性給予H2S供體NaHS后,阻斷P38MAPK可使HSC內Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達明顯降低,未給予抑制劑的NaHS可促進HSC增殖,增加Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達,此結果與Schnabl等[8]研究結果相似,證實了H2S通過P38MAPK信號通路參與調節(jié)HSC內Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達。推測H2S通過激活P38MAPK信號通路作用于HSC,HSC活化伴隨NF-κB激活,活化的NF-κB通過抑制肝細胞凋亡且促進HSC增殖,引起ECM增多,膠原是ECM的最主要成分,從而引起Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達增高。由于課題組前期研究結果已證實H2S對肝纖維化具有保護作用,膠原蛋白的最終表達才能對肝纖維化起明顯指示作用,那么翻譯過程中是否由于某種機制使高表達的mRNA翻譯為低表達的蛋白質而使膠原產生減少,從而起到抗肝纖維化作用;且本實驗僅研究H2S對HSC的作用,H2S對肝細胞是否也能夠促增殖產生膠原使其高表達,其具體作用機制還尚未可知。在此需要注意的是,上述研究結果提示阻斷P38MAPK信號通路可以明顯抑制H2S刺激的HSC增殖,促進其凋亡,這與Schnabl等[8]的研究結果又有所不同,考慮可能與如下原因有關:MAPK信號通路包括P38、ERK和JNK等,本實驗僅用SB203580阻斷P38MAPK信號通路,這是否是由于P38MAPK信號通路與細胞內其他信號通路產生交叉反應,又或者MAPK信號通路各分支間存在協(xié)同或干擾效應,具體機制尚需進一步研究。
Figure 1 Changes in cell morphology under inverted microscope(×200)圖1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化(×200)
Figure 2 Comparison of apoptotic rates in HSC T6 cells between groups圖2 各組HSC-T6細胞凋亡率的比較
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