袁 敏 劉 斌 唐 靜 李世英

自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象[1]，它是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化成熟及死亡的重要調(diào)控機(jī)制[2]，與帕金森病[3]、阿爾茨海默病[4]和腦血管病[5]等多種疾病有關(guān)。Beclin-1為自噬相關(guān)基因，參與自噬體的形成，目前已作為自噬的標(biāo)志分子用于檢測(cè)自噬活性[6]。細(xì)胞凋亡與血管性癡呆（vascular dementia,VD）的發(fā)病過(guò)程關(guān)系密切[7]，但自噬和凋亡在VD發(fā)病過(guò)程中共同作用的研究較少。本研究旨在觀察自噬相關(guān)蛋白Beclin-1與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2在VD大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)及變化情況，探討其在VD發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。清潔級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2010-0013。在河北聯(lián)合大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫控制在（23±2）℃，自然光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。（2）主要試劑和儀器。兔抗鼠Be?clin-1多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京博奧森公司，DAB顯色試劑盒、TUNEL檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。Morris水迷宮購(gòu)自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，電凝儀器購(gòu)自張家港市航天醫(yī)療電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和VD模型組，每組又隨機(jī)分為模型制備成功后1、2、4、8、12周5個(gè)亞組（各6只）。

1.2.2 VD模型制備 采用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法制作VD模型[8]。大鼠于術(shù)前禁食12 h，用10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉后，背側(cè)頸正中切口，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突小孔，用直徑0.5 mm電凝針插入雙側(cè)翼小孔燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。再將大鼠仰臥固定，同時(shí)行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以4號(hào)絲線穿線備用。24 h后用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)動(dòng)脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h。術(shù)后手術(shù)部位施以慶大霉素噴灑處理以抗感染，然后縫合，常規(guī)飼養(yǎng)觀察。假手術(shù)組步驟同上，但不做缺血處理。術(shù)后連續(xù)3 d給予慶大霉素，預(yù)防感染。

1.2.3 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)前5 d，分別對(duì)各組大鼠采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試學(xué)習(xí)記憶能力，包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)[9]。

1.2.4 標(biāo)本制備 各組大鼠在學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試結(jié)束后，立即以致死量10%的水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，快速滴入37℃生理鹽水300 mL，無(wú)血污后改為滴入固定液4℃的多聚甲醛400 mL。待大鼠尾巴完全僵直時(shí)迅速斷頭，取出腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中12～24 h，進(jìn)行脫水透明及石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片，厚度約3 μm，用經(jīng)多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片撈片，晾干后置于60℃的烤箱中烘烤備用。

1.2.5 Beclin-1和Bcl-2檢測(cè) 采用免疫組化SABC法，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作要求進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下觀察，Beclin-1蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于胞漿內(nèi)；Bcl-2蛋白染色呈棕黃色顆粒，位于核膜或胞漿內(nèi)。高倍鏡下觀察皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)不重疊的6個(gè)視野，進(jìn)行Beclin-1、Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±ss表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩變量間關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)分析法，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)結(jié)果 第1、2天，各組大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間沒(méi)有明顯差異。從第3天起，模型組大鼠平均逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1、Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)在不同時(shí)間點(diǎn)可見(jiàn)Beclin-1、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)。模型組1周時(shí)可見(jiàn)Beclin-1、Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，4周達(dá)至高峰，8周開(kāi)始下降，至12周仍較高。與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)的Beclin-1、Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05或Plt;0.01），見(jiàn)表1、2，圖1、2。

Table 1 Comparison of the positive expression of Beclin-1 in hippocampal CA1 area at different time points between two groups表1 2組大鼠海馬CA1區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)Beclin-1陽(yáng)性表達(dá)數(shù)比較（n=6，個(gè)/高倍視野，x±s）

Table 2 Comparison of the positive expression of Bcl-2 in hippocampal CA1 area at different time points between two groups表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)數(shù)比較 （n=6，個(gè)/高倍視野，x±s）

2.3 VD大鼠海馬CA1區(qū)Beclin-1與Bcl-2表達(dá)的關(guān)系 VD大鼠海馬CA1區(qū)的Beclin-1與Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.809，Plt;0.05）。

3 討論

采用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法制備大鼠VD模型是較理想的VD動(dòng)物模型。本研究應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試，觀察各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示，模型組大鼠平均逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，符合VD模型判定標(biāo)準(zhǔn)，提示造模成功。

自噬是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy relat?ed gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體、噬泡降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程[10]，屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，主要由溶酶體酶激活來(lái)執(zhí)行。Beclin-1是酵母At96/Vps30基因的同源物，Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)可與Beclin-1形成復(fù)合物參與自噬體的形成。因此，Beclin-1是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)反映了自噬的活性[6]。本研究顯示VD大鼠海馬CA1區(qū)1周時(shí)Beclin-1表達(dá)升高，4周達(dá)到高峰，8周開(kāi)始下降，至12周仍較高，模型組各時(shí)間點(diǎn)的Beclin-1表達(dá)均高于假手術(shù)組，說(shuō)明在大鼠海馬CA1區(qū)自噬明顯增強(qiáng)，細(xì)胞自噬可能參與了VD的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

細(xì)胞凋亡是一種不同于壞死及自噬性死亡的細(xì)胞生理性死亡方式。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]，Bcl-2的高表達(dá)可阻止多種凋亡因子所致的細(xì)胞死亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。在本實(shí)驗(yàn)中，VD大鼠海馬CA1區(qū)1周時(shí)Bcl-2表達(dá)升高，4周達(dá)到高峰，8周開(kāi)始下降，至12周仍較高。與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)的Bcl-2表達(dá)均明顯增高，說(shuō)明在VD大鼠海馬CA1區(qū)存在細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡參與了VD的發(fā)病過(guò)程。

自噬是繼壞死和凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3種細(xì)胞死亡形式，與疾病的發(fā)生息息相關(guān)，是目前細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。自噬、凋亡和壞死3種現(xiàn)象在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下的發(fā)生順序一直是國(guó)內(nèi)外爭(zhēng)論的熱點(diǎn)。有研究者認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞遭遇應(yīng)激時(shí)，自噬最先被激活，當(dāng)自噬不能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)后，細(xì)胞再繼發(fā)凋亡，最后進(jìn)入壞死[12]。也有研究者認(rèn)為，自噬與凋亡重疊發(fā)生，平行執(zhí)行功能，互為補(bǔ)充，共同維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，抵御應(yīng)激損傷[13]。本研究顯示，VD大鼠海馬CA1區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)數(shù)與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)數(shù)呈正相關(guān)，表明血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞自噬和凋亡同時(shí)發(fā)生，且表達(dá)趨勢(shì)一致。

自噬與凋亡作為程序性細(xì)胞死亡的2種不同形式，二者之間可能存在復(fù)雜聯(lián)系，對(duì)二者的深入研究，有助于揭示血管性癡呆發(fā)生發(fā)展過(guò)程的內(nèi)在機(jī)制，為血管性癡呆的治療提供新的理論依據(jù)。

Figure 1 The expression of Beclin-1 in hippocampal CA1 area of rats at different time points between two group（immunohistochemistry，×200）圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)Beclin-1表達(dá)（免疫組化，×200）

Figure 2 The expression of Bcl-2 in hippocampal CA1 area at different time points between two group（immunohistochemistry，×200）圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2表達(dá)（免疫組化，×200）

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