相 平 孫 靜 周宇捷 任 杰 劉堂喻哼 李會(huì)強(qiáng)△

近年來(lái)，食物不耐受現(xiàn)象越來(lái)越普遍，已成為國(guó)內(nèi)、外研究的重點(diǎn)[1-2]。食物不耐受的診斷主要依靠病史、雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)和體外過(guò)敏原特異性免疫球蛋白G（sIgG）檢測(cè)[3]。與食物過(guò)敏性疾病相比，食物不耐受引起的臨床表現(xiàn)不典型，依靠病史很難做出明確診斷；雙盲安慰劑對(duì)照試驗(yàn)因程序復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)未在國(guó)內(nèi)廣泛使用。血清sIgG具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、高通量等優(yōu)點(diǎn)，備受臨床重視和歡迎。檢測(cè)血清sIgG作為確認(rèn)不耐受食物的重要依據(jù)，同時(shí)監(jiān)測(cè)血清sIgG的變化可評(píng)價(jià)脫敏治療的效果。當(dāng)前檢測(cè)血清sIgG主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）[4-5]。臨床廣泛使用的試劑盒是由美國(guó)BIOMERICA公司生產(chǎn)的。此試劑是以14種食物為組合的固定模式，缺乏靈活性，不適于患者個(gè)性化檢測(cè)，更不適合已確診患者脫敏治療時(shí)對(duì)單一抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。因雞蛋被認(rèn)為是引發(fā)食物不耐受反應(yīng)最常見(jiàn)的食物之一[6]，故本研究以雞蛋為例，嘗試?yán)蒙锼?鏈酶親和素系統(tǒng)，建立一種新型的雞蛋不耐受sIgG定量檢測(cè)方法，以期為今后研制“個(gè)性化”隨機(jī)組合食物過(guò)敏原sIgG檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2012年10月—2013年7月于天津市人民醫(yī)院行食物過(guò)敏原sIgG檢測(cè)的門(mén)診和住院患者173例。其中，符合臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BIOMERI?CA公司）診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的陽(yáng)性患者有95例，男40例，女55例，平均年齡（45.22±14.34）歲，其血清sIgG均大于50 U/mL；另?yè)窠】刁w檢者78例為陰性對(duì)照，男29例，女49例，平均年齡（38.66±10.84）歲，其血清sIgG均小于50 U/mL。

1.2 材料及儀器 生物素化牛血清白蛋白（biotinylated bo?vine serum albumin,Bio-BSA，購(gòu)自Equitech-Bio公司，貨號(hào)：BAH67-0050），鏈霉親和素（購(gòu)自PIERCE公司，貨號(hào)：21122），長(zhǎng)臂活化生物素（Sulfo-NHS-LC-Biotin，Thermo Piece，貨號(hào)：21335），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-抗人IgG（購(gòu)自SouthernBiotech，貨號(hào)：6140-05），卵類(lèi)黏蛋白（Ovomucoid，OVM）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（Ovotrans?ferrin，OVT）、溶菌酶（Lysozyme，Ly）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)分別為T(mén) 2011-250 MG、A 5503-1 G、C 0755-100 MG、L 6876-1 G；96孔酶標(biāo)反應(yīng)板（美國(guó)Costar公司）。低溫高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN COULTER OptimaTML-80 XP）、酶標(biāo)分析儀（Bio-Tek公司EXL-800型）。

1.3 制備生物素化的食物蛋白 取新鮮雞蛋2枚，分離蛋清和蛋黃，采用丙酮沉淀法制備蛋清提取液[7]。按1∶5的體積比加入-20℃預(yù)冷丙酮，于4℃去脂24 h。然后3 000 r/min離心30 min，將沉淀通風(fēng)揮干后稱(chēng)質(zhì)量。按8 mL/g溶于0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）中，于4℃提取24 h。最后離心，收集上清液，即為蛋清粗提液。測(cè)定溶液的濃度，分裝后-20℃保存。蛋黃提取液的制備方法與此相同。

雞蛋抗原的生物素標(biāo)記方法參照文獻(xiàn)[8]并略作調(diào)整。用0.1 mol/L NaHCO3（pH 9.5）溶液配制1 g/L的待偶聯(lián)抗原。用二甲基甲酰胺配制20 g/L的生物素。按一定比例計(jì)算生物素的用量，然后將生物素緩慢、逐滴加入待偶聯(lián)抗原溶液中，邊滴加邊攪拌。全加入后室溫?cái)嚢? h。在4℃下用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）溶液透析24 h，充分除去游離生物素。分裝貯存，4℃放置備用。

1.4 生物素-鏈酶親和素化酶標(biāo)反應(yīng)板的制備 依據(jù)生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素酶標(biāo)反應(yīng)板制備方法（專(zhuān)利號(hào)：201110068782.9），制備生物素-鏈酶親和素化酶標(biāo)反應(yīng)板[9]。取聚苯乙烯微孔板每孔加150 μL生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液，室溫過(guò)夜。洗板2次，每次10 min。每孔加150 μL鏈霉親和素包被緩沖液，室溫2 h。洗板2次，加入封閉液，4℃過(guò)夜。真空干燥后備用。

1.5 生物素化抗原的選擇 隨機(jī)抽取10例陰性血清和10例陽(yáng)性血清，分別混合制備陰性和陽(yáng)性混合血清。采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法測(cè)定混合血清中sIgG的含量。每個(gè)標(biāo)本做復(fù)孔，計(jì)算其平均值，選擇陽(yáng)性血清吸光度值（AP）與陰性血清吸光度值（AN）比值最大的生物素化抗原，作為本方法所選用的抗原。

1.6 生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素ELISA方法的建立 取制備的生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素酶標(biāo)反應(yīng)板1個(gè)，每孔加入25 μL待測(cè)血清（預(yù)先1∶20倍稀釋?zhuān)?，然后加?00 μL生物素抗原，37℃溫育1 h；洗板5次，拍干；加入HRP-抗人IgG 125 μL，37 ℃溫育30 min；再洗板5次，拍干；在反應(yīng)孔中加入底物A、B各1滴，室溫反應(yīng)10 min；在反應(yīng)孔中加終止液1滴，用Bio-Tek EXL-800酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度（A）值。用方陣滴定法，即不同濃度生物素化抗原和HRP-抗人IgG進(jìn)行組合，以標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及AP/AN最大值作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇生物素化抗原和HRP-抗人IgG的最佳稀釋度。

1.7 sIgG定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將食物不耐受sIgG的強(qiáng)陽(yáng)性混合血清稀釋成不同濃度，以臨床現(xiàn)用食物過(guò)敏原sIgG檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BIOMERICA公司）檢測(cè)，分別以0、50、100、200、400 U/mL作為標(biāo)準(zhǔn)品，用以上得到的最優(yōu)反應(yīng)條件檢測(cè)其450 nm處A值，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 方法學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)

1.8.1 精密度 取高、中、低值濃度的血清，在同一次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)sIgG的含量，每個(gè)樣本平行做10次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV）；在不同實(shí)驗(yàn)日檢測(cè)高、中、低值樣本中sIgG的含量，每個(gè)樣本平行做10次，計(jì)算批間CV。

1.8.2 特異性 隨機(jī)抽取13例其他食物sIgG陽(yáng)性、雞蛋sIgG陰性的血清，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋?zhuān)捎帽緦?shí)驗(yàn)建立的方法測(cè)定A值，計(jì)算與其他食物sIgG的交叉反應(yīng)情況。

1.8.3 正常參考值上限的確定 選取50例正常人血清，用本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定雞蛋sIgG的濃度，計(jì)算A值的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，以標(biāo)準(zhǔn)曲線反算出平均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差所對(duì)應(yīng)的濃度值即為正常人雞蛋sIgG參考值上限。

1.8.4 與臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測(cè)試劑盒的比較 隨機(jī)抽取20例臨床標(biāo)本，分別用本實(shí)驗(yàn)建立的方法和臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測(cè)試劑盒測(cè)定雞蛋sIgG的含量，采用相關(guān)性分析對(duì)2種檢測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，相關(guān)分析采用直線相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物素化抗原的選擇 生物素化蛋清提取物（Bio-蛋清）的AP/AN值最大（均P＜0.05），A值在酶標(biāo)儀的檢測(cè)范圍內(nèi)，能將陰陽(yáng)性血清區(qū)分開(kāi)，因此將Bio-蛋清作為本方法所選用抗原，見(jiàn)表1。

Table 1 The choice of biotin allergens表1 生物素化抗原的選擇 （x±s）

2.2 Bio-蛋清和HRP-抗人IgG最佳工作濃度的確定 Bio-蛋清提取物的最適稀釋比例是1∶2 000，酶標(biāo)抗體的最適稀釋比例是1∶12 000，此時(shí)的AP/AN值最大，見(jiàn)表2。

Table 2 The best concentration of biotinylation egg white and HRP-anti human IgG表2 Bio-蛋清和HRP-抗人IgG最適濃度的方陣滴定結(jié)果

2.3 sIgG定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以sIgG的濃度為橫坐標(biāo)，以A值為縱坐標(biāo)，用Logistic曲線擬合（四參數(shù)）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其劑量-反應(yīng)曲線見(jiàn)圖1。

Figure 1 Standard curve for specific IgG圖1 血清sIgG標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度檢測(cè) 高、中、低濃度血清的批內(nèi)及批間CV均小于10%，說(shuō)明本方法具有良好的重復(fù)性，見(jiàn)表3。

Table 3 Within-run and between-run of different serum-concentrations表3 不同濃度血清的批內(nèi)及批間變異

2.4 特異性 與蟹不耐受患者血清的交叉反率為7.61%，與牛、羊奶不耐受患者血清的交叉反應(yīng)率為1.33%，與蘑菇、雞油菌、牛肝菌不耐受患者血清的交叉反應(yīng)率為0.17%。

2.5 正常參考值上限 結(jié)果呈正態(tài)分布，正常人sIgG參考值上限為50 U/mL。

2.6 與臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測(cè)試劑盒的比較 以臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測(cè)試劑盒的測(cè)定值作為橫坐標(biāo)，以本實(shí)驗(yàn)建立方法的測(cè)定值為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，對(duì)兩種方法的測(cè)定值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)建立的方法與臨床現(xiàn)用食物不耐受sIgG檢測(cè)法有較好的相關(guān)性，回歸方程為=0.977X+8.45，r=0.961，見(jiàn)圖2。

Figure 2 Linear correlation between biotin-avidin ELISA and current clinical test for sIgG圖2 生物素-親和素ELISA法與臨床現(xiàn)用sIgG檢測(cè)法的相關(guān)性

3 討論

食物不耐受的臨床表現(xiàn)主要有腹瀉、皮膚反應(yīng)、頭痛、哮喘等，其與多種慢性病有關(guān)，可累及消化、皮膚、神經(jīng)、心血管等全身多個(gè)系統(tǒng)，其中以消化系統(tǒng)最為常見(jiàn)[10]。消化系統(tǒng)疾病尤其是慢性腹瀉、炎癥性腸病、慢性胃炎等出現(xiàn)食物不耐受的比例達(dá)93.3%，且同時(shí)對(duì)2種以上的食物不耐受的比例高達(dá)90%[11-12]。有研究表明，蛋清或蛋黃、蟹、牛奶是最主要的常見(jiàn)不耐受食物[13]。然而，由于其具有起病隱匿、涉及食物較多、診斷困難的特點(diǎn)，患者難以自我發(fā)現(xiàn)敏感食物。如不及時(shí)治療，這種免疫損傷將會(huì)不斷積累，引發(fā)一系列慢性癥狀或疾病，給患者帶來(lái)長(zhǎng)期困擾。

目前國(guó)內(nèi)用于定量測(cè)定食物sIgG含量的國(guó)產(chǎn)試劑盒較少，主要依賴(lài)國(guó)外進(jìn)口。臨床廣泛使用的試劑盒是由美國(guó)BIOMERICA公司生產(chǎn)的，此種試劑由廠家預(yù)先將14種食物蛋白包被于微孔板表面，其檢測(cè)食物種類(lèi)的組合模式無(wú)法改變，缺乏靈活性，更不適合已確診患者脫敏治療時(shí)對(duì)單一抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，造成多余的檢測(cè)和漏檢，同時(shí)會(huì)增加檢測(cè)成本，不易在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用。

本文引入生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素-生物素化抗原間接包被ELISA法檢測(cè)食物不耐受sIgG。由于鏈霉親和素對(duì)生物素具有高度親和力（親和常數(shù)為1×1015/mol），與生物素結(jié)合后形成非常穩(wěn)定的復(fù)合物，很難解離。因此，可以實(shí)現(xiàn)抗原的即時(shí)包被。一方面，牛血清白蛋白來(lái)源方便、包被方式簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好，保留了抗原活性，提高抗原利用效率。另一方面，有研究表明，通過(guò)這種間接包被模式可最大限度減少包被抗體的空間位阻效應(yīng)，提高抗體的利用效率，降低實(shí)驗(yàn)成本[14]。這種間接包被的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于多種檢測(cè)指標(biāo)，如妊娠相關(guān)蛋白A、人絨毛膜促性腺激素、抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體[9,15-16]等并取得較好效果。

本實(shí)驗(yàn)以雞蛋為例，利用生物素化牛血清白蛋白-鏈酶親和素-生物素化抗原間接包被模式檢測(cè)血清中sIgG濃度。研究顯示，此種新型酶聯(lián)免疫模式具有較好的精密度和特異性。本方法與美國(guó)BIO?MERICA公司生產(chǎn)的試劑盒具有較好的相關(guān)性，可用于檢測(cè)食物不耐受sIgG含量。食物不耐受涉及的種類(lèi)繁多，對(duì)于其他不耐受食物的新型檢測(cè)方法還有待推廣和改進(jìn)。在試劑盒進(jìn)一步優(yōu)化和廣泛驗(yàn)證后，就可以根據(jù)患者需要選擇疑似不耐受食物，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化檢測(cè)，相當(dāng)于從“套餐式”改進(jìn)為“訂單式”，具有十分重要的意義。了解食物不耐受現(xiàn)象，判斷產(chǎn)生不耐受的食物品種，通過(guò)針對(duì)性的禁食或少食不耐受食物可以有效地改善癥狀，控制疾病，改善健康狀況，從而避免不耐受食物造成的不良影響，遏制疾病發(fā)生和發(fā)展。

[1]Zugasti Murillo A.Food intolerance[J].Endocrinol Nutr，2009，56(5)：241-250.

[2]Ho MH,Wong WH,Chang C.Clinical Spectrum of Food Allergies:a Comprehensive Review[J].Clin Rev Allergy Immunol,2012,Nov 16.[Epub ahead of print]

[3]Vojdani A.Detection of IgE，IgG，IgA and IgM antibodies against raw and processed food antigens[J].Nutr Metab(Lond),2009,6:22.

[4]趙知明，付君，金會(huì)文.食物不耐受IgG抗體檢測(cè)研究進(jìn)展[J].中華健康管理學(xué)雜志，2012，6（5）343-344.

[5]Patfiarca G，Schiavino D，Pecora V，et al.Food allergy and food in?tolerance：diagnosis and treatment[J].Intern Emerg Med.2009，4(1):11-24.

[6]王萍，李會(huì)強(qiáng)，陳寅，等.天津地區(qū)食物過(guò)敏患者sIgG檢測(cè)結(jié)果分析[J].天津醫(yī)藥，2011，39（7）：580-582.

[7]王萍，陳寅，穆曉燕，等.3種雞蛋清過(guò)敏原提取方法的評(píng)價(jià)[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2010，28（4）：305-307.

[8]楊靜，曾邵偉，王學(xué)謙，等.人血清癌胚抗原的生物素-親和素ELISA檢測(cè)方法的建立[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28（8）：871-875.

[9]孫穎，李會(huì)強(qiáng)，陳寅，等.血清抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體ELISA定量方法的建立[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2011，29（8）：615-617.

[10]Guandalini S,Newland C.Differentiating Food Allergies from Food Intolerances[J].Curr Gastroenterol Rep,2011,13(5):426-434.

[11]張國(guó)軍，呂虹，周亞莉，等.食物不耐受檢測(cè)臨床意義的探討[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（5）87-88.

[12]莊瑩，林志輝.食物不耐受及與消化系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].國(guó)際消化病雜志，2012，32（5）292-295.

[13]郭虹，江濤，王金梁，等.食物不耐受在腹瀉型腸易激綜合癥中的作用[J].天津醫(yī)藥，2011，9（10）957-958.

[14]NIAID-Sponsored Expert Panel,Boyce JA,Assa'ad A,et al.Guide?lines for the diagnosis and management of food allergy in the United States：report of the NIAID-sponsored expert panel[J].J Allergy Clin Immunol,2010,126(6 Suppl):S1-S58.

[15]孔令青，李勇，高洪.生物素-親和素標(biāo)記技術(shù)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008,29（4）：100-102.

[16]李靈俊，陳淑蓮，李向東，等.妊娠相關(guān)血漿蛋白A定量測(cè)定方法的建立 [J]天津醫(yī)藥，2010，38（5）356-359.

[17]陳淑蓮，李向東，李靈俊，等.間接包被ELISA法檢測(cè)血清游離β-HCG[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2010，28（4）:267-268.