劉 英 郭世杰 閆昆明 嚴超英 王明惠 王飛宇 傅連弟 韓 軍

(吉林大學第一醫(yī)院兒科，長春130021)

流感是最為嚴重的呼吸道傳染病之一，在世界范圍內(nèi)造成極高的發(fā)病率和死亡率［1］。世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，流感的流行每年在全球造成約300萬至500萬例嚴重疾病和約25萬至50萬例死亡，嚴重威脅人類的生命健康［2］。目前，接種流感病毒疫苗被認為是預防流感發(fā)生與控制病毒傳播的最佳方法［3］。迄今為止，尚無國產(chǎn)的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗上市。為評價國產(chǎn)甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗對小鼠的免疫效果，我們將大連雅立峰生物制藥有限公司研制的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗進行了動物實驗研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病毒 本試驗所用甲型H1N1流感病毒來源于英國國家生物制品檢定所(NIBSC)。

1.2 疫苗 由大連雅立峰生物制藥有限公司研制的甲型 H1N1流感病毒亞單位疫苗，共 9批:Y20120401、Y20120402、Y20120403 含血凝素 20 μg/ml;Y20120404、Y20120405、Y20120406 含血凝素30 μg/ml;Y20120407、Y20120408、Y20120409 含血凝素 40 μg/ml。

1.3 實驗動物及雞胚 清潔級昆明小鼠190只，12～14 g，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心;10日齡健康雞胚，來源于封閉飼養(yǎng)的健康雞群。

1.4 主要試劑 霍亂弧菌濾液(菌液):購自Sigma公司;1%紅細胞懸液:由新鮮的雞血球配制而成;壓積血球:將新鮮雞血經(jīng)PBS緩沖溶液或生理鹽水洗滌離心后，取下層沉淀血球即得;4個血凝單位抗原的配制:將已知血凝滴度的甲型H1N1毒種稀釋為4個血凝單位的病毒懸液。

1.5 動物分組及免疫 將9批疫苗分別免疫小鼠，腹腔注射0.5 ml/只，每批疫苗又分為1針組、2針組，每組10只，2針免疫間隔1周，同時設對照組(不予免疫)。首針免疫21天后，分別采血，分離血清，同組混合進行血凝抑制抗體和中和抗體的測定。

1.6 血凝抑制(HI)抗體的測定 取待檢血清25 μl，加入霍亂弧菌濾液(去除血清中的非特異性抑制素，此物質(zhì)能夠與紅細胞表面受體結(jié)合，影響HI效價的判定)100 μl，37℃水浴16 小時后，56℃水浴50分鐘，滴入壓積血球，4℃冰箱中和2小時，離心后取上清。在“U”孔板上從1∶5倍起進行對倍稀釋，稀釋后每孔均加入25 μl 4個血凝單位抗原，室溫放置60分鐘。每孔加入1%紅細胞懸液25 μl，振蕩均勻后，置室溫40分鐘觀察結(jié)果，以能完全抑制紅細胞凝集的最高血清稀釋度的倒數(shù)為血凝抑制抗體的效價，HI抗體效價≥1∶40為陽轉(zhuǎn)。

1.7 中和抗體的測定 將待檢血清經(jīng)霍亂弧菌濾液常規(guī)處理后進行稀釋至1∶640，然后分別與100EID50病毒液等量混合，置室溫中和1小時，中和后立即接種10日齡雞胚，每個稀釋度接種4只，每只0.2 ml，置 33 ～35℃ 培養(yǎng) 72小時，冷胚，取尿囊液做直接血凝，以雞胚尿囊液發(fā)生紅細胞凝集為陽性，并以出現(xiàn)2個雞胚發(fā)生感染的最高血清稀釋度的倒數(shù)為血清中和抗體的效價，中和抗體效價≥1∶200為陽轉(zhuǎn)。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用幾何均數(shù)計算各試驗組小鼠的平均血凝抑制抗體效價，雞胚半數(shù)感染法判定中和抗體效價。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行多因素方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血凝抑制(HI)抗體效價比較 不同免疫次數(shù)的各組小鼠，健康狀況均良好，體重均增加。血凝素含量為20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗1針組、2針組 HI抗體效價均小于1∶40(F=1.77，P ＞0.05)。HI抗體效價≥1∶40 為陽轉(zhuǎn)，故血凝素含量為20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗免疫1針組、2針組小鼠均未陽轉(zhuǎn)。血凝素含量為30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗1針組、2針組的HI抗體效價均大于1∶40(F=59.85，P ＜0.01)，血凝素含量為 30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗1針組和2針組的血凝抑制抗體效價比較，差異均無統(tǒng)計學意義(F=1.67，P ＞0.05，見表1)。

2.2 各組中和抗體效價比較 血凝素含量為20μg/ml的流感病毒亞單位疫苗1針組、2針組的中和抗體效價均小于 1∶200(F=2.39，P ＞0.05);血凝素含量為30、40 μg/ml的流感病毒亞單位疫苗1針組、2針組的中和抗體效價均大于1∶200(F=62.15，P ＜0.01)，血凝素含量為 30、40 μg/ml的流感病毒亞單位疫苗1針組和2針組的中和抗體效價比較，差異均無統(tǒng)計學意義(F=2.49，P ＞0.05)，見表2。

表1 各組免疫小鼠血清的HI抗體水平Tab.1 Serum HI antibody titers of all groups

表2 各組免疫小鼠血清的中和抗體水平Tab.2 Serum neutralizing antibody titers of all groups

3 討論

目前國際上人用流感疫苗的研究技術已較成熟，先后發(fā)展了多種疫苗制備技術，包括全病毒流感疫苗、裂解流感疫苗、亞單位流感疫苗，有效控制了流感疫情的傳播。國內(nèi)外的臨床研究均表明，流感病毒亞單位疫苗相比全病毒疫苗和裂解疫苗，經(jīng)過進一步純化，具有更高的純度，不含流感病毒基質(zhì)蛋白和核蛋白，在良好地保留了免疫原性的前提下，接種后副反應更為輕微，尤其適用于兒童［4，5］。

與流感病毒侵襲力及免疫保護力相關的流感病毒的抗原主要有血凝素(Hemagglutinin，HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)、核蛋白(Nuclear protein，NP)和基質(zhì)蛋白 (Matrix protein，M)等［6］。研究表明，血凝素是流感病毒亞單位疫苗的有效免疫成分［7-9］。血凝素抗體能中和病毒，是最主要的保護性抗體［10］。因此，大連雅立峰生物制藥有限公司研制了以血凝素為有效免疫成分的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗。通過對不同血凝素含量的流感病毒亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生的血凝抑制抗體效價、中和抗體效價之間的比較，血凝素含量為30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗的免疫效果能夠達到設定標準，即血凝抑制抗體效價＞1∶40，中和抗體效價＞1∶200，并且均明顯優(yōu)于血凝素含量為20 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗。同時，通過對不同免疫次數(shù)的比較，血凝素含量為30、40 μg/ml的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗1針組和2針組對小鼠的免疫原性無差異，以上實驗結(jié)論表明甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗血凝素含量直接影響其免疫原性，且血凝素含量為30 μg/ml接種1針即可達到理想的免疫效果。

本研究證實大連雅立峰生物制藥有限公司研制的甲型H1N1流感病毒亞單位疫苗具有較好的動物免疫原性，為國產(chǎn)流感亞單位疫苗的臨床試驗奠定了基礎。

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3 徐 偉，翟力軍，崔德軍et al.醫(yī)務人員計劃接種季節(jié)性和甲型H1N1流感疫苗情況調(diào)查［J］.中華流行病學雜志，2010;3l(6):714-715.

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6 Taubenberger J K，Morens D M，Influenza:the once and future pandemic［J］.Public Health Rep，2010;125(Suppl 3):16-26.

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8 Van Damme P，Arnou R，Kafeja F et al.Evaluation of non-inferiority of intradermal versus adjuvanted seasonal influenza vaccine using two serological techniques:a randomised comparative study［J］.BMC Infect Dis，2010;10:134.

9 Gildea S，Arkins S，Walsh C et al.A comparison of antibody responses to commercial equine influenza vaccines following annual booster vaccination of National Hunt horses-a randomised blind study［J］.Vaccine，2011;29(22):3917-3922.

10 邵惠訓.流感疫苗的現(xiàn)狀與未來［J］.國際病毒學雜志，2010;17(4):110-115.