黃 帥,王 汀

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病,人病死率約100%[1]。暴露后最有效的防治手段是及時清洗傷口、接種免疫球蛋白及全程接種人用狂犬病疫苗[2-3]?？袢∫呙缰饕ㄟ^培養(yǎng)動物性細胞獲得,如Vero細胞疫苗、原代地鼠腎細胞疫苗及人二倍體細胞疫苗[4]。人二倍體細胞疫苗,系采用健康人胚肺成纖維細胞(MRC-5)培養(yǎng)狂犬病病毒,經(jīng)培養(yǎng)、收獲、濃縮、滅活病毒、純化后制備而成,有著無潛在致瘤DNA殘留和無外源蛋白過敏風(fēng)險的優(yōu)勢,且具有更好的免疫原性[5]。

佐劑為一種非特異性免疫增強劑,能增強機體對抗原的免疫應(yīng)答,增強免疫反應(yīng)。BCG-CpG-DNA佐劑為一種新型生物佐劑,是從卡介菌(Bacillus Calmette Guerin vaccine,BCG)中提取的富含未甲基化CpG基序,該核酸片段具有強烈的免疫激活功能。其主要功能為刺激巨噬細胞、DC、B細胞等細胞成熟活化,激活TLR9受體,從而介導(dǎo)激活固有免疫并誘導(dǎo)機體建立強烈的Th1型免疫反應(yīng);并誘導(dǎo)IFN-α/β和IFN-γ等多種細胞因子的分泌,促進抗病毒反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,提高抗體水平[6-7]。

Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子,可通過檢測IL-2、IFN-γ細胞因子表達水平來體現(xiàn)機體Th1型免疫反應(yīng)的強弱。

本研究評價了BCG-CpG-DNA佐劑人用狂犬病疫苗(MRC-5細胞)在食蟹猴體內(nèi)的免疫原性?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 疫苗 BCG-CpG-DNA佐劑人用狂犬病疫苗(MRC-5細胞)由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司制備,1.0 mL/劑;凍干人用狂犬病疫苗(人二倍體細胞)由成都康華生物制品有限公司生產(chǎn),1.0 mL/劑。

1.2 實驗動物 普通級食蟹猴12只,雌雄各半,3～5歲,雄性體重 3.33～4.98 kg,雌性體重 2.56～3.29 kg,由廣西防城港常春生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK桂2018-0005。

1.3 主要試劑及儀器 RFFIT實驗用狂犬病人免疫球蛋白國家標準品購自中國食品藥品檢定研究院;RFFIT實驗用FITC標記抗狂犬病病毒核蛋白抗體,購自德國默克密理博公司;倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;熒光化學(xué)發(fā)光分析儀購自美國CTL公司;Monkey IL-2ELISpotPLUS(ALP)及Monkey IFN-γELISpotPRO(ALP)細胞因子檢測試劑盒購自MABTECH公司。

1.4 動物分組及免疫 將12只食蟹猴隨機分為對照組、3針組及4針組,每組4只,雌雄各半,經(jīng)后肢肌肉免疫,1.0 mL/劑。對照組接種市售凍干人用狂犬病疫苗(人二倍體細胞),按薩格勒布(Zagreb)方案[8],于0 d(2劑)、7 d及21 d各1劑,共4劑;4針組及3針組均接種BCG-CpG-DNA佐劑疫苗(MRC-5細胞);4針組按美國ACIP方案[9],于0 d、3 d、7 d及14 d各注射1劑,共4劑;3針組在Zagreb方案基礎(chǔ)上,將0 d的免疫降為1劑,其他免疫程序不變,共3劑。于初免當(dāng)天(0 d)及初免后7 d、14 d、28 d、35 d、49 d、63 d后肢隱靜脈采血,分離血清及外周血淋巴細胞,分別進行體液免疫中和抗體檢測和細胞免疫細胞因子檢測。

1.5 免疫原性分析 采用《中國藥典》(四部)(現(xiàn)行版)中的快速熒光灶抑制試驗(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)檢測食蟹猴血清中抗狂犬病病毒中和抗體,以血清中和抗體效價<0.5 IU/mL判為陰性,≥0.5 IU/mL判為陽性[10]。采用酶聯(lián)免疫斑點檢測技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)檢測食蟹猴免疫前后外周血淋巴細胞中細胞因子IL-2及IFN-γ的表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 抗狂犬病病毒中和抗體水平 免疫前,各組食蟹猴血清中抗狂犬病病毒中和抗體水平均呈陰性,抗體轉(zhuǎn)陽率均為0%;首劑免疫后7 d,各組血清中抗體均>0.5 IU/mL,抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%。初次免疫后7～28 d,對照組及3針組血清中抗體水平呈上升趨勢,至28 d達最高,之后均呈下降趨勢;4針組在14 d達最高,之后呈下降趨勢。初次免疫后28 d,對照組、3針組中和抗體水平顯著高于4針組(t=2.529、4.068;P<0.05、P<0.001);初免后35 d,3針組中和抗體水平顯著高于4針組(t=3.277,P<0.01),其他同時間點各組血清中和抗體水平未發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學(xué)差異;免疫后血清中抗體總水平為3針組>對照組>4針組,見表1,免疫后各組血清中和抗體變化趨勢見圖1。

圖1 各組食蟹猴血清中不同免疫時間抗狂犬病病毒中和抗體水平趨勢圖

表1 各組食蟹猴血清中不同免疫時間抗狂犬病病毒中和抗體水平

2.2 細胞免疫水平分析 初次免疫后,各組食蟹猴外周血淋巴細胞中IL-2水平在7～14 d呈上升趨勢,至14 d達最高,之后呈下降趨勢,同時間各組外周血淋巴細胞中IL-2水平均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,免疫后IL-2總水平為3針組>4針組>對照組。初次免疫后,對照組外周血淋巴細胞中IFN-γ水平在7～28 d呈上升趨勢,至28 d達最高,之后呈下降趨勢;3針組及4針組IFN-γ水平在7～14 d呈上升趨勢,至14 d達最高,之后呈下降趨勢;初免后14 d,3針組IFN-γ水平顯著高于對照組,其他同時間點各組間IFN-γ水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義;免疫后IFN-γ總水平為3針組>4針組>對照組,佐劑疫苗組IFN-γ較對照組的提前至14 d達高表達水平,見表2,免疫后外周血淋巴細胞中IL-2、IFN-γ水平變化趨勢見圖2。

圖2 各組食蟹猴外周血淋巴細胞中不同免疫時間細胞因子水平

表2 各組食蟹猴外周血淋巴細胞中不同免疫時間細胞因子水平(斑點數(shù)/孔,

3 討 論

狂犬病作為死亡率最高的傳染病之一,一旦發(fā)病,目前沒有有效的藥物可以治療[11]。接種狂犬病疫苗是預(yù)防狂犬病感染的必要途徑,但在一些發(fā)展中國家的使用仍然不足,致命的感染數(shù)量很高[12]。其中,人二倍體細胞疫苗作為國際公認的金標準疫苗,生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價格昂貴、限制其廣泛應(yīng)用[13]。因此新一代狂犬病疫苗研發(fā)需要降低成本和減少接種程序[14],而添加佐劑成為熱門研究方向,歷史上曾經(jīng)使用過鋁佐劑的狂犬病疫苗,但由于其延緩中和抗體產(chǎn)生的時間,并且只誘導(dǎo)體液免疫,反而不利于狂犬病的預(yù)防[15],基于此,目前上市的滅活狂犬病疫苗都未添加佐劑,這也導(dǎo)致需要使用高濃度的抗原來確保免疫效果,從而導(dǎo)致高昂的成本。因此需要開發(fā)新型的佐劑狂犬病疫苗,通過提高免疫效果、降低成本,以助力WHO提出的2030年消滅人間狂犬病的目標[16]。

目前人們一直致力于狂犬病疫苗新型佐劑的研究,如鞭毛蛋白佐劑、植物型多糖佐劑、CpG佐劑[17-18]等,其中BCG-CpG-DNA 作為天然的富含未甲基化CpG基序,與TLR9特異性結(jié)合,具有明顯的免疫激活作用,被認為是一種有效的新型疫苗佐劑[19],已有研究證實在小鼠等模型中CpG可以減少狂犬病毒抗原使用量和免疫球蛋白使用量[20],但對免疫程序的研究尚有不足,尤其在非人靈長類模型中。目前,我國狂犬病暴露后推薦的免疫程序為5針法和2-1-1法,在2018年《狂犬病疫苗:WHO立場文件》中推薦暴露后免疫程序為簡易4針法和2-1-1法。在保證效果的同時節(jié)約費用和就醫(yī)程序,可以顯著提高患者依從性、減輕負擔(dān)[21]。因此,在本實驗中使用4針法及簡易3針法來探討B(tài)CG-CpG-DNA佐劑狂犬病疫苗的免疫效果。在本實驗中將食蟹猴隨機分為3針組、4針組及對照組,各組食蟹猴血清檢測結(jié)果顯示,3針組、4針組及對照組免疫前血清樣本中抗狂犬病病毒中和抗體水平均<0.5 IU/mL,呈陰性;在初次免疫7 d的抗體陽轉(zhuǎn)率均達100%,該陽性狀態(tài)可維持至少63 d;對照組和3針組在28 d抗體滴度均達最高,分別為215.95 IU/mL、293.20 IU/mL;4針組在14 d抗體滴度達最高,為100.95 IU/mL,遠超過《狂犬病預(yù)防控制指南(2016版)》規(guī)定的0.5 IU/mL陽轉(zhuǎn)值標準。初免后28 d,對照組、3針組中和抗體水平顯著高于4針組。免疫后14 d開始,3針組中和抗體均值均大于4針組,免疫后28 d開始,3針組中和抗體平均值均大于對照組,整體血清抗體水平表現(xiàn)為3針組>對照組>4針組。顯示該佐劑疫苗在減少免疫劑量的情況下體液免疫反應(yīng)未降低。

3針組和4針組食蟹猴初次免疫后,外周血淋巴細胞表達的IL-2及IFN-γ水平均在14 d達最高,其中3針組IFN-γ的水平顯著高于對照組,4針組IFN-γ平均值約為對照組2倍;對照組IL-2細胞因子表達水平趨勢與3針組及4針組一致,但IFN-γ水平在首免后28 d才達最高,但平均值與3針組、4針組的14 d表達水平相當(dāng)。整體細胞因子水平表現(xiàn)為3針組>4針組>對照組,顯示該佐劑疫苗可能更早的引起機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答,且在減少劑量的情況下細胞免疫反應(yīng)未降低。

綜上所述,接種BCG-CpG-DNA佐劑人用狂犬病疫苗(MRC-5細胞)和接種市售凍干人用狂犬病疫苗(人二倍體細胞)后均能引起食蟹猴較高水平的特異性免疫應(yīng)答,且該佐劑狂犬病疫苗在簡易3針免疫程序下,產(chǎn)生的細胞免疫和體液免疫不弱于對照組的2-1-1程序,表明該佐劑疫苗具有較高的保護水平,較全面協(xié)同的體液免疫和細胞免疫保護機制,并可能減少免疫接種針次,在優(yōu)化狂犬病疫苗免疫接種程序中具有潛在價值。

利益沖突：無