任 靜,黎圣洪

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性嗜氧菌,屬兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌,它引起的布魯氏菌病是一種人獸共患病,畜類布魯氏菌病主要癥狀為母畜流產(chǎn)、公畜睪丸炎,人類感染布魯氏菌主要表現(xiàn)為長期反復(fù)的波狀熱、乏力、多汗、肌肉和關(guān)節(jié)疼痛等。自1887年首次從死于“馬耳他熱”的英國士兵的脾臟中分離到布魯氏菌以來[1],經(jīng)100多年的研究,共有12種布魯氏菌被發(fā)現(xiàn)[2]。目前布魯氏菌病仍是中國主要的公共衛(wèi)生問題之一[3],根據(jù)我國疾病預(yù)防控制局(http://www.nhc.gov.cn)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,2017-2021年中國人間布魯氏菌病的發(fā)病率分別是2.79/10萬、2.73/10萬、3.15/10萬、3.36/10萬、4.91/10萬,整體呈現(xiàn)上升趨勢,發(fā)病率的上升給我國公共衛(wèi)生、畜牧業(yè)、社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來負(fù)擔(dān)。人布魯氏菌病的一線治療方案是多西環(huán)素聯(lián)合利福平或鏈霉素,效果不理想或存在禁忌時,可采用多西環(huán)素與復(fù)方新諾明或妥布霉素聯(lián)合用藥,或喹諾酮類聯(lián)合利福平作為二線治療方案[4]。但隨著抗菌藥物的使用,布魯氏菌出現(xiàn)耐藥,給臨床治療帶來挑戰(zhàn),因此了解其耐藥性和機(jī)制對改善患者預(yù)后極其重要。

分析2013-2022年有關(guān)動物源、人源布魯氏菌耐藥性研究的文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn):動物源布魯氏菌監(jiān)測的動物對象以牛、羊?yàn)橹?極少數(shù)篇目未注明布魯氏菌種類[5],大多數(shù)篇目都是關(guān)于羊種、牛種布魯氏菌;人源布魯氏菌的種類絕大多數(shù)是羊種。本文就2013-2022年發(fā)表的關(guān)于牛羊源布魯氏菌(主要為羊、牛種)和人源布魯氏菌(主要為羊種)耐藥性與耐藥機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述。

1 不同來源的布魯氏菌耐藥性

1.1 來自牛羊的菌株 通過分析近10年發(fā)表的牛源、羊源布魯氏菌耐藥監(jiān)測結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn),全球多地牛羊源布魯氏菌耐藥現(xiàn)象都較為嚴(yán)重,南非甚至出現(xiàn)耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣的現(xiàn)象,對利福平、阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、紅霉素的耐藥率甚至達(dá)到100%,這可能和上述藥物在當(dāng)?shù)厥褂脮r間較長,應(yīng)用范圍較廣有關(guān)。對多西環(huán)素、四環(huán)素的耐藥情況各地區(qū)有差異,埃及、中國新疆、伊朗德黑蘭的牛羊源布魯氏菌以及土耳其羊源布魯氏菌對四環(huán)素的耐藥率小于30%,中國新疆、伊朗德黑蘭、吉爾吉斯斯坦牛羊源布魯氏菌對多西環(huán)素的耐藥率小于30%,而南非牛羊源布魯氏菌對多西環(huán)素耐藥率大于70%,對四環(huán)素耐藥率大于30%,且南非、埃及、土耳其牛羊源布魯氏菌均存在多藥耐藥的情況。

表1 牛源、羊源布魯氏菌的耐藥性

Manafe等[5]收集南非地區(qū)牛、山羊、綿羊源的123株布魯氏菌進(jìn)行耐藥分析,發(fā)現(xiàn)牛羊源布魯氏菌對利福平、阿莫西林、多西環(huán)素、四環(huán)素、青霉素G、頭孢克肟、紅霉素的耐藥趨勢大致相同,總體耐藥情況都比較嚴(yán)峻。對于復(fù)方新諾明、頭孢西丁牛源的耐藥水平明顯高于羊源。這種現(xiàn)象表明,同一地區(qū)不同種類動物宿主所分離得到的布魯氏菌藥物敏感性各不相同,可能是由于不同動物使用抗菌藥物種類和劑量不同所致。

Khan等[11]埃及的研究人員對收集自牛、羊的29株布魯氏菌進(jìn)行了藥敏檢測,結(jié)果顯示羊種布魯氏菌(21株)環(huán)丙沙星、紅霉素、亞胺培南、利福平的耐藥率為76.2%、19%、76.2%、76.2%,而牛種布魯氏菌(8株)對環(huán)丙沙星、紅霉素、亞胺培南、利福平的耐藥率為25%、87.5%、25%、37.5%,提示同一地區(qū)不同種布魯氏菌的抗菌素耐藥率有顯著差異,該研究團(tuán)隊(duì)在所有利福平耐藥株中均檢測出利福平抗性基因(rpoB)突變,在4株羊種布魯氏菌的環(huán)丙沙星耐藥株中檢測出gyrA和gyrB基因的喹諾酮耐藥區(qū)點(diǎn)突變。

1.2 來自臨床的菌株 在布魯氏菌病治療中,布魯氏菌耐藥性檢測具有重要意義,但由于具備操作布魯氏菌的三級生物安全實(shí)驗(yàn)室單位少,所以布魯氏菌耐藥檢測開展少。1986年Jurica等[12]首次報告了多西環(huán)素、利福平雙聯(lián)治療羊種布魯氏菌患者期間出現(xiàn)利福平耐藥,該團(tuán)隊(duì)從患者首次治療前的血培養(yǎng)中分離出的布魯氏菌對6種抗生素都敏感(利福平MIC=1.0 mg/L),使用雙聯(lián)抗感染6周后停藥。在停藥3個月后,患者再次出現(xiàn)關(guān)節(jié)痛癥狀,此次血培養(yǎng)分離出的布魯氏菌對利福平耐藥(MIC=64 mg/L),后用多西環(huán)素聯(lián)合奈替米星聯(lián)合治愈了該患者。

通過分析人源布魯氏菌的耐藥性(表2),對比牛羊源、人源布魯氏菌的耐藥性,發(fā)現(xiàn)后者耐藥性明顯減弱,對于抗菌藥物的耐藥率多小于30%。人源布魯氏菌對利福平的敏感性減弱是世界范圍普遍存在的問題,這與利福平作為人間布魯氏菌病的一線用藥廣泛運(yùn)用有關(guān),但對利福平的耐藥率各地差異明顯。我國玉溪、內(nèi)蒙烏蘭察布、內(nèi)蒙興安盟、伊朗地區(qū)人源布魯氏菌對利福平的耐藥率小于3%,而哈薩克斯坦人源布魯氏菌對利福平的耐藥率高達(dá)26.4%。

表2 人源布魯氏菌的耐藥性

我國人源布魯氏菌除發(fā)現(xiàn)存在對利福平耐藥的菌株外,還發(fā)現(xiàn)對復(fù)方新諾明耐藥的現(xiàn)象。劉志國等[19]另外對我國各地149株羊種布魯氏菌在體外對利福平和復(fù)方新諾明的敏感性進(jìn)行了篩查,結(jié)果顯示有4株對利福平表現(xiàn)為中介敏感,而對復(fù)方新諾明的耐藥率高達(dá)25.5%(38/149)。另外,多篇來自內(nèi)蒙古地區(qū)的研究提示,該地區(qū)人源羊種布魯氏菌對阿奇霉素的耐藥率達(dá)到100%[18-20],建議臨床上停止使用。

Irajian等[9]檢測伊朗德黑蘭人源布魯氏菌的耐藥情況,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)人源布魯氏菌存在對四環(huán)素、慶大霉素、復(fù)方新諾明耐藥。而對伊朗馬哈丹、卡珊地區(qū)的人源布魯氏菌耐藥檢測卻未發(fā)現(xiàn)耐藥布魯氏菌株。提示同一國家不同地區(qū)人源布魯氏菌藥物敏感性各不相同。

這些布魯氏菌株抗藥性各不相同,可能是由于各國醫(yī)療衛(wèi)生情況和各國抗菌藥物使用水平不同導(dǎo)致,但也有學(xué)者提出實(shí)驗(yàn)方法的不同會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差別,Johansen等[24]從1991-2016年在挪威各地收集到來自臨床的23株羊種布魯氏菌,采用微量肉湯稀釋法(microdilution method)的藥敏結(jié)果提示有17株對利福平的敏感性降低,6株對利福平耐藥,而采用梯度條帶法(gradient strip method)的藥敏結(jié)果則顯示只有4株對利福平的敏感性降低,其余19株均對利福平敏感。在對上述菌株的耐藥基因檢測中發(fā)現(xiàn)了利福平抗性基因(rpoB)的突變,但rpoB突變與體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果并不相符。波黑地區(qū)的學(xué)者對臨床的108株羊種布魯氏菌分別使用布魯氏肉湯、陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯(加4%裂解馬血)、陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯(加5%脫纖維棉羊血)培養(yǎng)后進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示使用布魯氏肉湯組91株(84.3%)對復(fù)方新諾明耐藥,而陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯的兩組均無對復(fù)方新諾明耐藥,但大于90%的布魯氏菌在各個組別均對阿奇霉素耐藥[25]。不同實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異,應(yīng)結(jié)合臨床用藥療效予以鑒別。不同區(qū)域菌株敏感性的數(shù)據(jù)對指導(dǎo)當(dāng)?shù)嘏R床治療更有實(shí)際意義,在臨床用藥中應(yīng)予以考慮和重視。

2 布魯氏菌的耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀

2.1 利福平耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀 利福平屬于利福霉素類廣譜抗生素,它作用于細(xì)菌RNA聚合酶的β亞基,可抑制聚合酶活性,使細(xì)菌無法轉(zhuǎn)錄出完整的RNA而死亡。細(xì)菌對利福平的耐藥獲得主要通過:β亞基的編碼基因-rpoB基因突變導(dǎo)致β亞基對利福平的親和力降低、對藥物的修飾滅活、膜通過性改變、外排泵等方式使細(xì)菌耐藥[26]。對羊和牛種布魯氏菌的研究表明rpoB基因存在影響利福平抗性水平的高變位點(diǎn)(1560-1740位點(diǎn))[27]。楊曉雯等[28]在利福平濃度逐漸增高的情況下通過對羊布魯氏菌進(jìn)行連續(xù)傳代,獲得了對利福平具有高水平耐藥性的羊布魯氏菌耐藥菌株。他們的研究結(jié)果顯示耐藥菌株rpoB基因1606位點(diǎn)由C變?yōu)門,這與前人研究類似[27],該研究還發(fā)現(xiàn)利福平耐藥菌株中virB操縱子表達(dá)下調(diào),virB操縱子編碼的virB1-12蛋白與細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和形成持續(xù)性感染有關(guān)[29],而耐藥株通過降低virB操縱子基因的表達(dá)來抵御利福平的作用。楊曉雯等[30]又進(jìn)一步構(gòu)建了virB基因缺失的羊布魯氏菌株,采用布魯氏菌肉湯培養(yǎng)基觀測不同利福平濃度下基因缺失株和親本株的生長特性。3 d后virB7-11基因缺失株的利福平MIC值高于親本株,而virB1-6、virB12基因缺失突變株MIC值與親本株無差異,進(jìn)一步證實(shí)了virB7-11在羊布魯氏菌對利福平耐藥中起重要作用。

2.2 氟喹諾酮類耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀 氟喹諾酮類藥物主要通過抑制細(xì)菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶來干擾細(xì)菌DNA復(fù)制,從而起到抑制細(xì)菌增殖生長的作用。細(xì)菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有I、II、III、IV四種,其中拓?fù)洚悩?gòu)酶II又稱為DNA回旋酶。喹諾酮類藥物耐藥主要通過:DNA回旋酶和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV突變、外排泵以及質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥[31]。Turkmania等[32]通過體外實(shí)驗(yàn)觀察到耐藥牛種、羊種布魯氏菌在加入多重耐藥泵抑制劑羰基氰化物間苯腙(CCCP)后,細(xì)胞內(nèi)氟喹諾酮含量增加,推測布魯氏菌對氟喹諾酮耐藥有外排泵的參與。Turkmania等[33]還通過PCR技術(shù)對獲得的耐藥牛、羊種布魯氏菌株進(jìn)行DNA回旋酶編碼基因gyrA和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV編碼基因parC進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對左氧氟沙星耐藥的羊種布魯氏菌gyrA基因存在Asp(GAT)91→Asn(AAT)突變,對環(huán)丙沙星耐藥的羊種布魯氏菌gyrA基因存在Asp(GAT)91→Tyr(TAT)突變,對氧氟沙星耐藥的牛種布魯氏菌gyrA基因存在Ala(GCT)87→Val(GGT)突變,而在partC基因上未檢測到突變。Elisa等[34]在巨噬細(xì)胞模型中觀察羊種布魯氏菌對氟喹諾酮類藥物耐藥實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),羊種布魯氏菌出現(xiàn)對氟喹諾酮類藥物耐藥與gyrA位點(diǎn)發(fā)生突變有關(guān),耐藥株gyrA的第260位點(diǎn)均發(fā)生C→T突變,導(dǎo)致Ala(GCT)87→Val(GTT)改變,但這些突變株與野生非突變株相比,感染新巨噬細(xì)胞的能力和喹諾酮類藥物再次暴露后在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力無增強(qiáng)。

2.3 磺胺類耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀 磺胺類藥物主要通過與氨基苯甲酸(PABA)競爭二氫葉酸合成酶,阻止細(xì)菌二氫葉酸(FH2)合成進(jìn)而阻止四氫葉酸(FH4)合成,使DNA前體物質(zhì)嘌呤和嘧啶無法合成抑制細(xì)菌生長繁殖,細(xì)菌對磺胺類的耐藥性可通過:二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶的sul和dfrA基因突變[35]、二氫喋呤還原酶和二氫葉酸還原酶的folA和folP基因突變[36]、SmeVWX和SmeDEF外排泵的調(diào)節(jié)基因突變[37]產(chǎn)生。Johansen等[24]在23株布魯氏菌的耐藥基因檢測中發(fā)現(xiàn)與甲氧芐氨嘧啶耐藥相關(guān)基因folA和folP突變,但上述菌株的體外藥敏實(shí)驗(yàn)對復(fù)方新諾明并不耐藥。

2.4 氨基糖苷類耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀 氨基糖苷類藥物經(jīng)膜孔通道被動擴(kuò)散穿過細(xì)菌細(xì)胞外膜,再經(jīng)氧依賴行主動跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),特異性與核糖體30s亞基16sRNA的高保守位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而抑制細(xì)菌蛋白合成[38],現(xiàn)有的研究已經(jīng)證明細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥機(jī)制主要包括氨基糖苷類修飾酶的修飾作用[39]、細(xì)菌靶位突變[40]和藥物的攝取減少[41]等。我國學(xué)者楊曉雯等[38]從喜馬拉雅旱獺體內(nèi)分離出一株耐阿米卡星的牛種布魯氏菌(MIC≥512 mg/L),對其進(jìn)行基因分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該阿米卡星耐藥株具有編碼氨基糖苷3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶的阿米卡星耐藥基因(aph(3′)-IIa),并通過構(gòu)建質(zhì)粒的方式推測出可能是通過T3家族轉(zhuǎn)座子從沙門氏菌獲得,該耐藥基因可編碼氨基糖苷類抗生素修飾酶,通過修飾酶對氨基糖苷類抗生素進(jìn)行修飾,使其無法作用于細(xì)菌而產(chǎn)生耐藥性。

2.5 大環(huán)內(nèi)酯類耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀 大環(huán)內(nèi)酯類藥物主要通過抑制細(xì)菌蛋白合成,從而達(dá)到抗菌的目的[42]。細(xì)菌核糖體23S rRNA基因的單位點(diǎn)突變使大環(huán)內(nèi)脂類抗菌藥物與核糖體親和性下降,從而產(chǎn)生耐藥性[43],劉志國等[19]對85株阿奇霉素耐藥的羊種布魯氏菌進(jìn)行耐藥基因測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有耐藥菌株的23S rRNA基因的2 632位堿基出現(xiàn)T→C單位點(diǎn)突變,提示布魯氏菌23S rRNA轉(zhuǎn)肽酶中心的T/C點(diǎn)突變可能是一種羊種布魯氏菌對阿奇霉素耐藥的分子機(jī)制。

目前國內(nèi)外對布魯氏菌耐藥機(jī)制的研究較少,尤其缺少布魯氏菌對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類藥物耐藥機(jī)制的研究。

3 結(jié) 語

布魯氏菌的耐藥性、耐藥機(jī)制和耐藥基因攜帶情況是目前的研究熱點(diǎn)。中國布魯氏菌病發(fā)病率高,近年來也出現(xiàn)了關(guān)于利福平、復(fù)方新諾明等藥物耐藥菌株的報道。細(xì)菌耐藥監(jiān)測是掌握細(xì)菌耐藥性的手段,是臨床合理選擇抗菌藥物的數(shù)據(jù)支持,但目前布魯氏菌耐藥監(jiān)測覆蓋面不全,監(jiān)測到的耐藥率僅反應(yīng)參加監(jiān)測的區(qū)域耐藥情況,應(yīng)擴(kuò)大監(jiān)測覆蓋區(qū)域。利用基因檢測技術(shù)檢測標(biāo)本中耐藥基因的變化,將更多布魯氏菌耐藥基因納入到現(xiàn)有基因組數(shù)據(jù)庫,有助于了解布魯氏菌耐藥基因在布魯氏菌病流行規(guī)律中的作用;另一方面,通過觀察患者體內(nèi)布魯氏菌對特定藥物的耐藥基因突變,可了解國內(nèi)不同區(qū)域耐藥菌株的流行特點(diǎn)及趨勢,對有效防治耐藥菌株具有重要意義。

利益沖突：無