馬曉菁，鐘 旗，葉 鋒，谷文喜，劉麗婭，馬俊杰，薛 晶，易新萍

（新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

羊種布魯氏菌（Brucella melitensis）是引起綿羊和山羊布魯氏菌病（Brucellosis，以下簡稱布病）的重要病原，導致母羊不孕及流產，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[1]，同時也可導致人感染，對人類公共安全造成巨大威脅。近年來的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，羊種布魯氏菌仍然是我國的主要流行菌株[2]。羊種布魯氏菌共有3種生物型（生物型1、2和3），均能感染綿羊和山羊，但在不同地區(qū)，存在優(yōu)勢生物型差異。

疫苗免疫是防控布病的重要手段。在布病流行地區(qū)進行全群免疫是控制該病最適合的方式[3]。國際上普遍認為，羊種布魯氏菌弱毒Rev.1活疫苗是預防綿羊和山羊布病的最佳疫苗。歐洲大部分國家以及亞洲的部分國家廣泛使用該疫苗，用于綿羊及山羊的布病防控[4]。羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1是由Elberg等[5]1957年將Brucella melitensis強毒株6056通過兩步篩選獲得的，具有鏈霉素抗性。目前疫苗株Rev.1與羊種布魯氏菌野菌株的鑒別主要依靠其生長特性，如Rev.1生長緩慢且菌落較小，具有鏈霉素抗性[6]。研究表明，疫苗株Rev.1的鏈霉素抗性與編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因突變密切相關[7-9]。Axel等[10]對疫苗株Rev.1的rpsL基因進行序列分析發(fā)現(xiàn)，91位脯氨酸突變?yōu)榱涟彼帷?/p>

目的片段特定位點堿基突變常發(fā)生在某種限制性內切酶識別位點，造成酶切位點增加或消失，從而改變酶切性質。限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）就是利用這一特性，通過檢測致病基因已知的點突變進行直接基因診斷，也可以此作為遺傳標記進行連鎖分析，從而進行間接基因診斷。本研究以編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因為研究對象，利用羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1的鏈霉素抗性且與rpsL基因突變相關這一特點，建立了一種快速、準確鑒定羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1的 PCR-RFLP方法，為今后區(qū)分疫苗株Rev.1免疫與羊種布魯氏菌自然感染提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 羊種布魯氏菌減毒活疫苗株Rev.1、羊種布魯氏菌標準株16M：均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛種布魯氏菌疫苗株A19、pUC-19K、大腸桿菌E.coliDH5α克隆菌株：均由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 主要試劑 Brucella broth培養(yǎng)基和Brucella agar培養(yǎng)基：購自美國BD公司；PCR mix：購自北京莊盟生物技術有限公司；NciI限制性內切酶：購自NEB公司；質粒提取和膠回收試劑盒：購自Promega公司。

1.1.3 引物 根據(jù)Genbank已公開發(fā)表羊種布魯氏菌株16M序列（AE008917），應用Primer 5.0軟件設計rpsL基因相應的引物序列。上游引物RpslF：CATGAAGCGTCAGCTTCCTCT；下游引物RpslR：CTTGCCATGAAGCATGACTGGCA。擴增片段為681 bp。委托上海基康生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌AMOS-PCR鑒定 以羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1、羊種布魯氏菌標準株16M、牛種布魯氏菌疫苗株A19基因組DNA為模板，按照參考文獻[11]中的AMOS-PCR方法，組合插入序列IS711、牛種布魯氏菌（1.2.3a型）、牛種布魯氏菌（5.6.9.3b型）以及羊種布魯氏菌（1.2.3型）。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s，40 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.2.2 羊種布魯氏菌rpsL基因擴增 以羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1和羊種布魯氏菌標準株16M基因組DNA為模板，以RpslF和RpslR為引物，PCR擴增rpsL基因。反應程序為：95 ℃預變性 10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，72 ℃ 10 min，共30個循環(huán)。PCR產物切膠回收與pMD19-T載體混勻后，置4 ℃連接過夜、轉化、鋪板，37 ℃恒溫培養(yǎng)。挑取陽性單克隆菌落于含Amp+（50 mg/mL）LB液體培養(yǎng)基中，提取質粒送上海生工測序。

1.2.3rpsL基因PCR產物NciI酶切 分別將羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1和羊種布魯氏菌標準株16M 的rpsL基因PCR擴增產物 37 ℃ 2 h酶切，其中 NciI酶 0.5 μL、10×NEBuffer 1 μL、PCR 擴增產物6 μL，滅菌水補足至10 μL。

2 結果

2.1 布魯氏菌AMOS-PCR鑒定

對羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1、羊種布魯氏菌標準株16M、牛種布魯氏菌疫苗株A19進行AMOS-PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌A19擴增出498 bp條帶，羊種布魯氏菌Rev.1和16M均擴增出731 bp條帶（圖1）。

2.2 rpsL基因擴增

羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1和羊種布魯氏菌標準株16M分別擴增rpsL基因，均獲得681 bp條帶（圖2），與目的片段大小一致。測序結果與Genbank發(fā)表rpsL基因序列一致。

2.2 PCR產物NciI酶切

分別將羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1和羊種布魯

圖1 布魯氏菌AMOS-PCR擴增結果

圖2 rpsL基因PCR擴增結果

氏菌標準株16MrpL基因的PCR產物NciI酶切，電泳后可見標準株16M出現(xiàn)384 bp條帶，疫苗株Rev.1出現(xiàn)500 bp左右條帶（圖3）。

3 討論

羊種布魯氏菌的自然宿主是成年山羊和某些品種綿羊，能夠引起綿羊和山羊布病的發(fā)生和流行。牛種布魯氏菌和豬種布魯氏菌也會造成綿羊和山羊感染，但幾乎未見臨床病例[12]。近年來有報道顯示，牛乳中能分離到羊種布魯氏菌[13]，因此羊種布魯氏菌不僅對畜牧業(yè)發(fā)展造成威脅，同時影響人類健康。在布病防控和根除過程中，疫苗免疫具有重要意義。在我國，對羊免疫常選用弱毒活疫苗豬種布魯氏菌S2

[14-15]。但國際上公認，羊種布魯氏菌Rev.1是用于羊布病防控最有效的疫苗，在希臘、約旦、塔吉克斯坦、蒙古和西班牙等國家具有顯著的布病防控效果[16]，但免疫后的鑒別診斷成為亟待解決的問題。

圖3 rpsL基因PCR擴增產物NciI酶切

羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1為羊種1型布魯氏菌，與近年來我國主要流行的羊種3型布魯氏菌存在型的差異。目前AMOS-PCR方法能夠快速將羊種布魯氏菌與其它種型布魯氏菌區(qū)分，但羊種布魯氏菌型的鑒定依靠染料抑制、單項特異性血清凝集，以及噬菌體試驗結果判定，不僅耗時，而且增大了操作人員感染風險。

生物型的判定也無法最終區(qū)分疫苗株與野株。RFLP分析是以DNA指紋圖譜為基礎用于微生物分型鑒定的方法。Jensen[17]等利用該方法證實RB51菌株與其它牛種布魯氏菌株不同。Ridler[18]等用限制性內切酶SwaI消化綿羊附睪種布魯氏菌進行電泳后發(fā)現(xiàn)綿羊附睪種存在變種。在我國，駱利敏等[19]研究發(fā)現(xiàn)，豬種與犬種菌之間關系密切。

4 結論

本研究利用疫苗株Rev.1 編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因片段CCG突變?yōu)镃TG，導致酶切位點NciI缺失，建立了羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1的PCR-RFLP鑒定方法，可以快速、特異地區(qū)分羊種布魯氏菌疫苗株與野株。

[1] BLASCO J M. Animal brucellosis：Brucella ovis[M].NIELSEN K，DUNCAN J R，editors. Boca Raton：CRC Press，1990：351-378.

[2] 崔步云.中國布魯氏菌病疫情監(jiān)測與控制[J]. 疾病監(jiān)測，2007，22（10）：649-651.

[3] BLASCO J M. A review of the use of B. melitensis Rev.1 vaccine in adult sheep and goats[J]. Preventive veterinary medicine，1997，31：275-283.

[4] GARIN-BASTUJI B，BLASCO J M，GRAYON M，et al. Brucella melitensis infection in sheep：present and future[J]. Veterinary research，1998，29：255-274.

[5] ELBERG S S，F(xiàn)AUNCE K J R. Immunization against Brucella infection.VI. Immunity conferred on goats by a nondependent mutant from a streptomycin-dependent mutant strain of Brucella melitensis[J]. Journal of bacteriology，1957，73：211-217.

[6] ALTON G G，JONES L M，ANGUS R D，et al.Techniques for the brucellosis laboratory[J]. CAB direct，1988，13（6）：420.

[7] BJORKMAN J，SAMUELSSON P，ANDERSSON D I，et al. Novel ribosomal mutations affecting translational accuracy，antibiotic resistance and virulence of Salmonella typhimurium[J]. Molecular microbiology，1999，31：53-58.

[8] FINKEN M，KIRSCHNER P，MEIER A，et al. Molecular basis of streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis：alterations of the ribosomal protein S12 gene and point mutations within a functional 16S ribosomal RNA pseudoknot[J]. Molecular microbiology，1993，9：1239-1246.

[9] KENNEY T J，CHURCHWARD G. Cloning and sequence analysis of the rpsL and rpsG genes of Mycobacterium smegmatis and characterization of mutations causing resistance to streptomycin[J]. Journal of bacteriology，1994，176：6153-6156.

[10] CLOECKAERT A，GRAYON M，GRéPINET O.Identi fi cation of Brucella melitensis，vaccine strain Rev.1 by PCR-RFLP based on a mutation in the rpsL gene[J].Vaccine，2002，20（19/20）：2546-2550.

[11] 鐘旗，范偉興. 用AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的研究[J]. 中國人獸共患病學報，2007，23（7）：683-686.

[12] SHOME R，GUPTA V K，RAO K N，et al. Detection of Brucella melitensis Rev-1 vaccinal antibodies in sheep in India[J]. Advances in animal and veterinary sciences，2014，280（2）：19-22.

[13] 易新萍，馬曉菁，閆晶華，等. 牛乳樣品中布魯氏菌的分離和鑒定[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2013，1（35）：28-30.

[14] 丁家波，馮忠武. 動物布魯氏菌病疫苗應用現(xiàn)狀及研究進展[J]. 生命科學，2013，25（1）：91-99.

[15] 付湘云，馬曉菁，等.羊用布魯氏菌疫苗研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2015，36（5）：91-94.

[16] BLASCO J M. A review of the use of B.melitensis Rev.1 vaccine in adult sheep and goats[J]. Preventive veterinary medicine，1997，31（3/4）：275-283.

[17] JENSEN A E，EWALT D R，CHEVILLE N F，et a1.Application of pulse-field gel electrophoresis for differentiation of vaccine strain RB51 from fi eld isolates of Brucella abortus from cattle，bison，and elk[J].American journal of veterinary research，1995，56（3）：308-312.

[18] RIDLER A L，LEYLAND M J，F(xiàn)ENWICK S G，et a1. Demonstration of polymorphism among Brucella ovis field isolates by pulsed-field gel electrophoresis[J].Veterinary microbiology，2005，108（1/2）：69-74

[19] 駱利敏，崔步云，芮勇宇，等. 布魯菌脈沖場凝膠電泳圖譜分型研究[J]. 中華微生物學和免疫學雜志，2005，25（12）：1043.