楊平東，張明璀，曹立廷

（1.重慶榮昌高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)管委會，重慶 402460；2. 西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶 402460）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病，在全球范圍內(nèi)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須上報的動物疫病。對其檢測多年來一直是獸醫(yī)界研究的重點(diǎn)。當(dāng)前的CSFV實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有：ELISA、細(xì)胞培養(yǎng)、RT-LAMP[2]，以及以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的RT-PCR、RT-nest-PCR、RT-FQ-PCR[4]等。本研究的思路來源于Fukuda等[3]2009年對諾如病毒檢測方法的研究。由于CSFV基因組在總RNA提取過程中會大量損失，因此希望建立一個兩步法反應(yīng)，來擴(kuò)增病毒RNA模板，提高檢測靈敏度。首先利用核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）可以大量擴(kuò)增RNA的特點(diǎn)，來擴(kuò)增病毒RNA模板，增加第二步反應(yīng)中的模板含量，然后通過反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）進(jìn)一步擴(kuò)增獲得檢測結(jié)果，從而建立一種NASBA和RT-LAMP技術(shù)相結(jié)合的兩步法檢測方法（NASBA-RT-LAMP），為CSF的臨床快速診斷提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 毒株與試劑

CSFV毒株：重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離保存；dNTP、NTP：購自Promega公司；蛋白酶K、Taq酶：購自上海生工；T7 RNA聚合酶、RNase H和AMV和Bst DNA 聚合酶：購自NEB公司；DTT、Betaine（甜菜堿）、MgSO4：購自Sigma公司；RNA Marker RL1000、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 4.0與Prime Script One Step RT-PCR Kit Ver 2.0 ：購自TaKaRa公司；Nucleasefree water：購自Fermentas公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)測序結(jié)果，利用Primer Explorer V4設(shè)計外引物和內(nèi)引物。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 NASBA-RT-LAMP方法的建立

使用RNA提取試劑盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 4.0，TaKaRa） 提 取 模 板RNA，分別優(yōu)化NASBA反應(yīng)中的離子濃度、引物濃度、酶含量，確定最終反應(yīng)體系為20 μL（表2）。反應(yīng)程序：65 ℃加熱5 min，41 ℃冷卻5 min；迅速加入40 U T7 RNase，5 U AMV，0.5 U RnaseH，混勻，置于41 ℃反應(yīng)90 min，-20 ℃終止反應(yīng)。通過5%瓊脂糖電泳鑒定反應(yīng)結(jié)果。

RT-LAMP反應(yīng)體系（20 μL）見表3。反應(yīng)程序：65 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

表2 NASBA反應(yīng)體系

表3 RT-LAMP反應(yīng)體系

1.4 NASBA-RT-LAMP特異性檢測

使用建立的NASBA-RT-LAMP方法，對臨床上常見的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、乙型腦炎病毒（JEV）和CSFV進(jìn)行檢測。

1.5 NASBA-RT-LAMP、NASBA、LAMP與Nest-PCR靈敏度比較

以TakaRa公司提供的高純度單鏈RNA片段（200 ng/μL）為標(biāo)準(zhǔn)對照，取2 μL提取的RNA模板，使用Eppendprf 6131 Biophotometer的Traycell超微量核酸檢測模塊測定RNA含量，用無酶水（Nuclease-free water，F(xiàn)ermentas）做10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行NASBA-RT-LAMP、NASBA、RT-LAMP與RT-Nest-PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 NASBA-RT-LAMP方法電泳

通過5%的瓊脂糖電泳后，在900 bp處可見清晰的RNA條帶（圖1），說明第一步NASBA反應(yīng)獲得成功；然后通過2%的瓊脂糖電泳，可見十分清晰的梯形條帶（圖2），說明整個NASBART-LAMP反應(yīng)是可行的。

圖1 NASBA反應(yīng)的電泳圖

圖2 NASBA-RT-LAMP反應(yīng)電泳圖

2.2 NASBA-RT-LAMP特異性檢測

分別用臨床上常見的PRRSV、JEV和CSFV為模板，在相同條件下同時進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測表明，只有以CSFV為模板，才能擴(kuò)增出清晰的梯形條帶，而以PRRSV和JEV為模板，不能擴(kuò)增出條帶，表明此方法對CSFV有很強(qiáng)的特異性。NASBA-RT-LAMP的特異性檢測瓊脂糖凝膠電泳圖像見圖3。

2.3 4種檢測方法的靈敏度比較

圖3 NASBA-RT-LAMP反應(yīng)的特異性檢測

比較結(jié)果顯示：NASBA與RT-LAMP的最小檢測濃度都為 460 pg/μL；NASBA-RT-LAMP 與RT-Nest-PCR的檢測靈敏度相近，都為46 pg/μL；不過NASBA-RT-LAMP在模板濃度從460 ng/μL到46 pg/μL變化過程中，擴(kuò)增條帶的亮度都十分清晰（圖4），而RT-Nest-PCR擴(kuò)增條帶卻逐漸減弱，在模板濃度46 pg/μL時已非常模糊。4種檢測方法的靈敏度比較結(jié)果見表4。

圖4 NASBA-RT-LAMP反應(yīng)靈敏度的檢測

3 分析與討論

本試驗(yàn)結(jié)合NASBA與RT-LAMP技術(shù)，探索建立了一種兩步法檢測方法，整個反應(yīng)只需要恒溫水浴鍋即可完成。在反應(yīng)過程中首先通過NASBA技術(shù)提高病毒RNA模板含量，然后進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，最后通過瓊脂糖電泳方式來驗(yàn)證反應(yīng)結(jié)果。這樣既解決了NASBA反應(yīng)產(chǎn)物容易降解，不易電泳觀察的問題，也使RT-LAMP反應(yīng)的模板量增加，讓RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果更加清晰、準(zhǔn)確。

表4 4種檢測方法靈敏度比較

此方法的敏感性與RT-nest-PCR相當(dāng)，最小檢測量為46 pg/μL，與朱俊靈等[5]將LAMP技術(shù)和橫向流動試紙條技術(shù)（LFD）相結(jié)合建立的RTLAMP-LFD的靈敏度相當(dāng)，但低于Das等[6]建立的針對CSFV的熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)檢測靈敏度結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，NASBA-RT-LAMP反應(yīng)對CSFV檢測的敏感性取決于NASBA反應(yīng)的敏感性，當(dāng)模板濃度在46 pg/μL時，NASBA與RT-LAMP反應(yīng)通過瓊脂糖電泳檢測不到目的條帶。這有可能是因RNA擴(kuò)增量太低，不能通過電泳檢測到。而NASBA-RT-LAMP反應(yīng)，由于對NASBA反應(yīng)得到的RNA模板進(jìn)一步擴(kuò)增，所以在模板濃度為46 pg/μL時仍能得到非常清晰的梯形條帶。此方法

在反應(yīng)過程中不需要特別貴重的設(shè)備，從而為基層

CSFV檢測提供了一種新選擇。

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