張 靜，仲 亮，李 智，李秀男，范峻豪，劉春羽，張七斤

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

羊口瘡（ORF）又稱羊傳染性膿皰?。–E）、接觸傳染性膿皰性口炎，是由羊口瘡病毒（ORFV）引起的一種接觸性人獸共患病[1-2]。ORFV屬痘病毒科副痘病毒屬，基因全長139 kb，是痘病毒屬中最小的病毒。該屬成員還有偽牛痘病毒、牛丘疹性口炎病毒、新西蘭馬鹿副痘病毒[3-4]。ORFV基因組末端區(qū)域有許多免疫調(diào)節(jié)基因，其編碼的蛋白決定了病毒的宿主范圍、發(fā)病機理和毒力[5]。到目前為止，在GenBank數(shù)據(jù)庫中，具有全基因組序列的ORFV毒株有：美國株OV-SA00（登錄號AY386264）、OV-IA82（登錄號AY386263），德國株D1701（登錄號HM133903）和新西蘭標準株NZ2（登錄號DQ184476）[6]。這些毒株編碼132個基因[7]。ORFV基因編碼的含有毒力的蛋白主要有：病毒干擾素抑制蛋白（OVIFNR、ORF020），趨化因子結(jié)合蛋白（CBP、ORF112），GM-CSF/IL-2抑制蛋白（GIF、ORF117），病毒白細胞介素10（vIL-10、ORF127）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，ORF132）等。最近還有樣細胞凋亡抑制劑（Bcl-2、ORFV125）與信號通路抑制劑（NF-κB、ORF024）等被鑒定出來。由于兩頭末端區(qū)域的大多基因編碼的是與病毒

致病機制有關(guān)的蛋白，因此對ORFV相關(guān)毒力基因的了解與研究是其免疫學研究的基礎(chǔ)。研究清楚這些基因是否發(fā)生重組及非必須基因的替換等有助于其毒力基因生物學特性和病毒致病機制的研究。

本研究通過對ORFV/QD/2015強毒株與傳90代后毒株毒力相關(guān)基因的對比分析，為毒力相關(guān)基因在強弱毒株之間造成的差異提供試驗基礎(chǔ)，為解釋ORFV的免疫逃避機制與構(gòu)建新的基因工程疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株

ORFV/QD/2015分離株[8]，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院傳染病教研室分離保存。

1.2 細胞系

山羊皮膚成纖維細胞，由中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫提供。

1.3 主要試劑

DMEM、胰酶和胎牛血清等：購自Gibco公司；病毒DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，DL2000Marker、2×Easy Taq SuperMix、質(zhì)粒DNA提取試劑盒等：購自TIANGEN公司等。

1.4 主要儀器

凝膠成像系統(tǒng)Alph imager HPr（美國）、梯度PCR儀TAdvanced 96G（德國）、電泳儀（DYCP-328）等。

1.5 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的毒株OV-SA00全基因參考序列，參照已編碼的含有毒力的4組基因序列片段，用Primer 5.0生物軟件設(shè)計并合成特異性引物（表1）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 含有毒力的基因及其特異引物

1.6 PCR擴增及產(chǎn)物回收

在ORFV/QD/2015株與傳90代產(chǎn)生穩(wěn)定病變分離株的細胞培養(yǎng)液中提取病毒DNA。以提取的病毒DNA為模版，用2×Easy Taq Super Mix試劑盒配制 25 μL普通PCR反應(yīng)體系：2×Easy Taq Super Mix 12.5 μL， 上 游 引 物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，c DNA 模板1 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR 擴增反應(yīng)時退火條件為：ORF020：59 ℃ 45 s；ORF112：51.1 ℃ 45 s；ORF117：55 ℃ 45 s；ORF127：57 ℃ 45 s。

1.7 基因測序及生物信息學分析

將電泳檢測結(jié)果中條帶最亮的樣品送至上海生工生物工程股份有限公司測序。用DNA Star軟件將測序結(jié)果拼接，并用其中的Edit Seq軟件和MegAlign軟件，將強弱毒株相關(guān)毒力基因序列與網(wǎng)上已經(jīng)公布的序列進行比對，用DNAMAN軟件分析強毒株ORFV/QD/2015株與傳90代毒株的變化。

2 結(jié)果

2.1 強毒株與傳90毒株4組毒力有關(guān)基因的擴增成功擴增出強毒株與QD90株020、112、

117、127毒力相關(guān)基因擴增片段，目的片段大小與預(yù)期相符（表2、圖1）。

表2 擴增出的毒力相關(guān)基因目片段大小

圖1 QD強毒株與傳90代毒株基因目的片段PCR擴增結(jié)果

2.2 強毒株與傳90代毒株與已公布毒株相關(guān)毒力基因核苷酸同源性對比

將ORFV/QD/2015強毒株與傳90代后毒株質(zhì)粒測序結(jié)果的核苷酸與Genebank公布的9組ORFV全基因序列中的ORF020、ORF112、ORF117、ORF127基因核苷酸進行比對。結(jié)果顯示：ORFV/QD/2015強毒株ORF020基因與9組公布基因的相應(yīng)核苷酸序列同源性為97.2%～99.1%，而傳90代毒株ORF020基因相應(yīng)核苷酸序列同源性為96.9%～98.9%（圖2）；ORF112基因與9組基因的相應(yīng)核苷酸序列同源性為93.1%～95%，傳90代 后 毒 株 則 為92.8%～94.9%（ 圖3）；ORF117基因與7組基因的相應(yīng)核苷酸序列同源性為96.1%～98.9%，而傳90代后毒株相應(yīng)核苷酸序列同源性為95.5%～96.7%（圖4）；ORF127基因與9組基因的相應(yīng)核苷酸序列同源性為95.5%～97.9%，而傳90代后毒株相應(yīng)核苷酸序列同源性為93.9%～95.7%（圖5）。

圖2 QD強毒株與傳代90代毒株ORF020基因核苷酸同源性分析結(jié)果

圖3 QD強毒株與傳代90代毒株ORF112基因核苷酸同源性分析結(jié)果

圖4 QD強毒株與傳代90代毒株ORF117基因核苷酸同源性分析結(jié)果

2.3 強毒株與傳90代毒株毒力相關(guān)基因的氨基酸序列比對

根據(jù)測序結(jié)果，用DNA Star軟件推導出ORFV/QD/2015強毒株與傳90代毒株間各毒力相關(guān)基因?qū)?yīng)的編碼氨基酸序列，并與其他毒株毒力相關(guān)基因進行比對分析。

圖5 QD強毒株與傳90代毒株ORF127基因核苷酸同源性分析結(jié)果

結(jié)果顯示，兩個毒株的ORF020基因推導出的編碼氨基酸個數(shù)均為181個，且發(fā)生了7處變異（圖6）；兩個毒株的ORF112基因推導出的編碼氨基酸個數(shù)均為278個，且發(fā)生了52處變異（圖7）；兩個毒株的ORF117基因推導出的編碼氨基酸個數(shù)均為265個，并發(fā)生了14處變異（圖8）；兩個毒株的ORF127基因組推導出的編碼氨基酸個數(shù)均為186個，并發(fā)生了15處變異（圖9）。

圖6 QD強毒株與傳90代毒株及其他公布毒株的ORF020基因氨基酸序列比對結(jié)果

2.4 蛋白抗原指數(shù)分析

圖7 QD強毒株與傳90代毒株及其他公布毒株的ORF112基因氨基酸序列比對結(jié)果

圖8 QD強毒株與傳90代毒株及其他公布毒株的ORF117基因氨基酸序列比對結(jié)果

運用DNA Star中的Protean軟件，分析QD強毒株與傳90代毒株間各毒力相關(guān)基因編碼蛋白的抗原指數(shù)。抗原指數(shù)分析表明，4組毒力相關(guān)基因的抗原指數(shù)較高，說明抗原性較好。強毒株與傳90代毒株間的抗原指數(shù)發(fā)生了明顯變異（圖10）。

圖9 QD強毒株與傳90代毒株及其他公布毒株的ORF127基因氨基酸序列比對結(jié)果

圖10 QD強毒株與傳90代毒株之間抗原指數(shù)的比較

3 討論與結(jié)論

在病毒感染早期，ORF020作為毒力因子能夠抑制宿主干擾素（IFN）誘導的dsRNA依賴的酶的激活，從而阻止IFN誘導的病毒蛋白翻譯的終止，即可抑制干擾素的抗病毒機制[9]。ORF112（CBP）是早期表達的病毒復(fù)制編碼產(chǎn)物[10-11]。GIF是ORF117編碼的蛋白，是病毒感染晚期表達的蛋白，能夠抑制宿主免疫活性，在機體的抗病毒感染過程中發(fā)揮著相當重要的作用[12]。ORF127是ORFV作為痘病毒科中唯一一個發(fā)現(xiàn)含有IL-10編碼基因的病毒。該基因也是病毒感染早期表達的基因之一[13]。

從相關(guān)毒力基因的角度出發(fā)，本試驗提取強毒株ORFV/QD/2015與傳90代毒株的4組與毒力相關(guān)的的基因組DNA，通過擴增ORF020、ORF112、ORF117和 ORF127的 目 的 基 因， 并對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，通過測序找出兩毒株相同毒力基因片段，并分析其對應(yīng)關(guān)系。ORFV/QD/2015強毒株與傳90代毒株的質(zhì)粒測序結(jié)果與Genebank公布的9組ORFV全基因序列中的ORF020、ORF112、ORF117、ORF127基因的比對結(jié)果顯示，強毒株的4組毒力相關(guān)基因同源性比傳代毒株的同源性高，傳90代毒株的這4組毒力相關(guān)的基因發(fā)生了明顯變異。這個變化可能導致病毒致弱，后續(xù)將進行攻毒試驗，以驗證傳90代毒株的毒力是否致弱。ORFV毒力相關(guān)基因的變異可能與其毒力有很大聯(lián)系，這個變化可能與傳代過程中基因發(fā)生多處變異有關(guān)，也可能是這些毒力基因共同作用的結(jié)果。在今后，制備ORFV弱毒疫苗是否可以根據(jù)這幾個主要毒力基因的變異去研究，還有待進一步驗證。

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