張建芳，張水文，李建華，郭軍紅，徐 野

(北京軍區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，北京 100700)

微小RNA(microRNA，miRNA)已經(jīng)成為近年來生物學研究的熱點之一。miRNA對動物生長、發(fā)育、成熟的時序調控、組織細胞的增殖、凋亡與分化以及人類疾病的發(fā)生中均發(fā)揮著重要作用。本文就miRNA在卵巢中的表達及可能的功能做一文獻綜述。

1 miRNA概述

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性非蛋白質編碼的RNA分子，約含有19～25個核苷酸(3’端可有1～2個堿基長度的變化)。lin-4是Lee等［1］在研究秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的發(fā)育中最早發(fā)現(xiàn)的小分子，它能夠通過與其3’UTR結合，調控線蟲細胞的時序發(fā)育。隨后，在線蟲(C．elegans和C．briggsae)、果蠅(Drosophila melanogaster)、斑馬魚(Danio rerio)、HeLa 細胞、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)及人類等多種真核生物中克隆出了上百種類似lin-4的小分子 RNA［2－4］，命名為微小 RNA(microRNA，miRNA)。

miRNA有其自身的生物學生特性，研究發(fā)現(xiàn)大約50%的miRNA基因彼此相鄰、排列成簇，帶有自己獨立的轉錄啟動子［5］;其次，從低等的線蟲到人類，miRNA在進化上呈非常顯著的保守趨勢，let-7是最具有保守性的miRNA，miRNA的這一特征為生物的進化提供了有力的證據(jù)［3］;此外，miRNA的表達具有時序性和組織特異性，細胞和組織特異性以及表達水平的顯著變化，都提示我們miRNA可能參與了發(fā)育過程的調控，在復雜的調控網(wǎng)絡中發(fā)揮重要作用。

2 miRNA生物合成及其作用機制

目前，對于動物(尤其是人類)miRNA的生物合成過程已經(jīng)初步得到了詮釋。首先，miRNA基因的初級轉錄產(chǎn)物(pri-miRNA)在細胞核中被RNaseⅢDrosha 切割成前體 miRNA(pre-miRNA)［6，7］，在最初的剪切后，pre-miRNA在轉運蛋白exportin-5的作用下由核內轉運到胞質中，然后由另一種RNase IIIDicer進一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質一起組成RISC(RNA-induced silencing complex)復合體，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制［8］，miRNA生物合成過程如圖1所示。

miRNA對基因表達轉錄后調控通過翻譯促進、翻譯抑制和mRNA的降解這三種作用方式實現(xiàn)，多種生理功能(如細胞增殖、凋亡、分化以及代謝等)均受到miRNA對基因調控的影響。降解途徑主要發(fā)生在植物中，miRNA在動物中則主要通過翻譯抑制實現(xiàn)［9］。Vasudevan等的研究結果顯示，腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNFα)受 miR-369-3的調控促進作用是通過翻譯抑制而實現(xiàn)的［10］。

圖1 miRNA的生物合成［11］

3 miRNA在卵巢中的表達與功能

3.1 miRNA在卵巢中的表達

哺乳動物卵巢最重要的功能是卵母細胞發(fā)育和排卵。在卵巢中，顆粒細胞是產(chǎn)生雌激素的主要部位并將內分泌信號傳輸?shù)较鄳衅鞴?。卵巢體細胞為卵母細胞生長和發(fā)育提供支持和營養(yǎng)，顆粒細胞分泌LH，在LH峰到來時引起排卵。這些響應包括卵母細胞減數(shù)分裂、類固醇激素合成、卵泡發(fā)育、卵丘擴展、顆粒細胞黃體化和產(chǎn)生孕激素，最終促進卵母細胞成熟［12，13］。

卵巢上miRNAs通過RNase分解酶III的作用，使pre-miRNA轉化為成熟miRNA參與卵巢功能的調控。目前，利用Dicer敲除模型可進行miRNA在小鼠卵巢的功能研究。Dicer－/－導致卵巢卵子發(fā)生、卵母細胞成熟、排卵和不育等生殖障礙［14，15］。關于miRNAs在卵母細胞發(fā)育和成熟中的功能仍不十分清楚。然而，有研究表明卵巢中miRNAs通過作用于顆粒細胞發(fā)揮功能將在后面章節(jié)中詳細介紹。表達于小鼠卵巢的 miRNA有上百種，特定miRNA的功能及其靶基因還有待進一步研究。

目前，利用基因芯片和克隆技術，檢測了卵巢中miRNA的表達，結果顯示，在成年小鼠卵巢中表達122種miRNAs，而在新生小鼠卵巢中表達的miRNA有177種(進一步研究發(fā)現(xiàn)其中4種miRNAs在 Nobox－/－卵巢中顯著下調［16－18］。對小鼠顆粒細胞中miRNAs檢測結果表明，經(jīng)過hCG刺激后有3種miRNA顯著上調，以miR-132和miR-212上調最為顯著，同時有10種miRNA顯著下調，將體外培養(yǎng)的顆粒細胞用環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)處理，結果發(fā)現(xiàn)cAMP同樣可促進miR-132和miR-212的表達，進一步研究顯示，在顆粒細胞中miR-132和miR-212通過轉錄后調控的方式調控可與類固醇激素生成因子(steroidogenic factor 1，SF-1)相互作用的轉錄抑制子C-末端結合蛋白1(C-terminal binding protein1，CtBP1)蛋白水平的表達進而調控類固醇激素的合成和分泌［19］。在豬卵巢中，共檢測到58種miRNA，miR-31和miR-92在豬卵巢中呈高表達［16］。

在敲除動物模型中，利用經(jīng)典的AMH II型受體啟動子Cre(Amhr2Cre+)特異性敲除雌性生殖系統(tǒng)中的Dicer1，產(chǎn)生的Dicer1f1/f1;Amhr2Cre+雌鼠不育，而雄性小鼠具有正常的生育能力。而在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，Dicer1f1/f1;Amhr2Cre+雌鼠具有正常的交配能力，且具有正常的發(fā)情周期，卵子也可以正常受精，只是排卵率明顯下降。所以單純卵巢特異性敲除Dicer1并不能引起不育，Dicer1f1/f1;Amhr2Cre+雌鼠不育的主要原因可能與其輸卵管的表型變化有關［20］。

3．2 miRNA與生殖細胞和胚胎性腺發(fā)育

胚胎性腺發(fā)育是許多基因精密調控的結果，在性腺發(fā)育中miRNA可能通過參與調控某些基因的表達而發(fā)揮其生物學功能。Katsuhiko等［21］在9．5～13．5 dpc胚胎原始生殖細胞中，檢測到 4種miRNA表達下調，包括 miR-141，－200a，－200c和－323，miR-141和－200c都編碼于小鼠6號染色體(～2000 kb)中包含 Nanog，Stella/PGC7/Dppa3和Gdf3的片段，而且在人和小鼠中，miR-141和－200c的序列完全匹配，提示二者可能來源于相同的前體RNA(pri-RNA)，而且在小鼠和人的生殖細胞發(fā)育中具有相似的功能［22］。在11．5 ～13．5 dpc 胚胎性腺中，let-7家族成員let-7a，d，e，f和g在11．5 dpc性腺中表達上升，13．5 dpc時表達量最高，而這種上調作用僅在雄性原始生殖細胞中出現(xiàn)，這一結果提示miRNAs與原始生殖細胞中性別分化過程相關，而從13．5 dpc到出生前后的雄性生殖細胞中，miR-17-92維持高的表達水平，提示miR-17-92可能參與了雄性生殖細胞的進一步增殖［23］。

另外，miR-17-92家族成員(除了miR-17-3p外)均可在生殖細胞中檢測到，且呈高表達，而這種高的表達水平在生殖細胞發(fā)育中一直持續(xù)，表明miR-17-92家族可能與原始生殖細胞增殖有關密切的關系。此外，miR-17-92對哺乳動物癌癥細胞具有普遍的促進細胞增殖和存活的作用［24］。

在雞胚中，miR-202參與雞胚性別決定，而且miR-202*與雞胚性腺分化為睪丸具有密切的相關性。體內注射17-β雌二醇導致雌性雄性化以及雄性性腺中miR-202*表達降低到與雌性相似的表達水平。雌激素合成阻斷后，雌性性腺雄性化，這與miR-202*表達增加和下調卵巢FOXL2基因表達以及上調睪丸相關基因SRY和SOX9表達相關［25］。

我們前期的研究結果發(fā)現(xiàn)，miR-143參與小鼠原始卵泡的形成過程，通過抑制前顆粒細胞增殖和調控細胞周期蛋白的表達實現(xiàn)的［26］。

目前，關于miRNAs在卵母細胞發(fā)育和成熟過程中的功能及其合成途徑仍不十分清楚。有研究顯示Dicer－/－導致卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟以及排卵等 生 殖 障 礙［14，15，27］。miRNA 合 成 特 有 的 酶DGCR8敲除能特異性阻斷miRNA作用通路［28］，而定向敲除卵母細胞中的DGCR8，卵母細胞成熟不受影響［29］。對牛卵母細胞研究顯示NOBOX是miR-196a潛在的靶基因，在牛早期胚胎發(fā)育中，miR-196a調控內源性NOBOX的表達，此時miRNAs不僅抑制轉錄，而且還可能誘導了目標 mRNA的清除［30］。

3．3 miRNA與顆粒細胞功能及卵巢激素調控

Yao等研究結果顯示miR-224通過促進cyp19a1基因表達促進小鼠腔前卵泡顆粒細胞17β-雌二醇的分泌，對孕酮分泌沒有顯著影響，進一步研究顯示，miR-224通過介導TGF-b1/Smad4信號通路調控小鼠顆粒細胞增殖［31］。此外，在研究miRNAs影響人卵巢細胞性腺類固醇激素分泌中，特異性抑制孕酮、睪酮和雌二醇的作用的miRNA分別為36、51和57種，而特異性促進孕酮和雌二醇的分泌的miRNA分別為10和1種，結果表明具有抑制性腺類固醇激素分泌的miRNA占多數(shù)［32］;其中miR-378通過下調顆粒細胞芳香化酶活性抑制雌激素合成［33］。

顆粒細胞中LH誘導排卵和黃體化。研究結果表明，小鼠在注射hCG/LH 4 h后，顆粒細胞中顯著上調的 miRNA有14種，其中 miR-132、miR-212和miR-21表達量上升最為明顯，進一步研究顯示，當miR-21的表達下降到基礎水平的2/7時誘導顆粒細胞凋亡［34］，體內實驗也證實miR-21具有抑制顆粒細胞凋亡的功能。Ma等［35］研究表明miR-378在黃體顆粒細胞凋亡中通過靶基因γ-干擾素受體1(interferon gamma receptor 1，IFNGR1)發(fā)揮抑制功能。

在哺乳動物卵巢中，卵巢顆粒細胞在雌激素和孕激素分泌中發(fā)揮重要作用，而雌激素和孕酮的周期性變化對于正常雌性生殖活動的維持是必需的，目前研究結果顯示，性腺激素與miRNA的相互作用對于卵巢功能的維持發(fā)揮著至關重要的作用［36］。

關于激素與miRNA之間的關系，LH/hCG調控miRNAs的表達是近年來普遍認可的觀點，LH/hCG可上調卵巢顆粒細胞中miR-132和miR-212的表達，miR-132是通過靶基因C-terminal結合蛋白(C-terminal binding protein 1，CTBP1)在轉錄后調控顆粒細胞的功能。在卵巢中，follicle stimulating hormone(FSH)卵子發(fā)生中不僅促進顆粒細胞的增殖和分化［37］，而且促進腔前卵泡發(fā)育為排卵前卵泡，在顆粒細胞中，F(xiàn)SH可上調17種miRNA的表達，被FSH下調的miRNA有14種，同時FSH可促進顆粒細胞孕激素的分泌。miR17-5p和let-7b缺乏可導致小鼠黃體化不足和不孕，這種效應可通過卵巢注射內miR17-5p和let7b被逆轉，表明miRNAs在黃體形成和功能維持中發(fā)揮重要作用［38］。

最近研究表明，許多miRNA參與人卵巢細胞的類固醇激素合成，其中有19種miRNAs對孕激素、雄激素和雌激素合成起抑制作用(miR-108、miR-135、miR-146、miR-19a、miR-20、miR-27、miR-28、miR-29、miR-125b、miR-126、 miR-137、miR-184、miR-31、miR-105、miR-128、miR-129、miR-132、miR-140和miR-188)，推測這些miRNA對內分泌器官活性發(fā)揮生理抑制功能;有7種miRNA促進孕酮分泌(miR-18、miR-24、miR-25、miR-32、miR-122、miR-125和miR-182)［36］。Kuokkanen 等通過對子宮 miRNA的研究結果顯示，在分泌期子宮中表達上調的12種miRNAs包括 miR-29b/c、miR-30b/d、miR-31、miR-193a-3p、 miR-203、miR-204、miR-200c、miR-210、miR-345和miR-582-5p，而在分泌期子宮中，孕酮是重要的促進因子，此時被上調的miRNAs的靶基因預測結果顯示大多是參與細胞周期調節(jié)的一些蛋白，如 cyclins、Cdks和/或轉錄因子 E2F3 等［31］。

3．4 miRNA與卵巢病理

近年來，通過對腫瘤中miRNA的研究結果顯示，miRNAs可能作為某些特定腫瘤組織的生物學標記物，在許多病理診斷中提供有用的檢測手段。在卵巢中，Iorio等［39］通過對腫瘤組織和正常組織比較分析，結果顯示miRNA在卵巢上皮組織中表達差異，其中，卵巢癌組織中過表達的miRNA包括miR-200a、miR-141、miR-200c 和 miR-200b，而明顯下調的有 miR-199a、miR-140、miR-145 和 miR-125b1。卵巢功能早衰(premature ovarian failure，POF)組織中，miR-202、miR-146a、miR-125b-2* 、miR-139-3p、miR-654-5p、miR-27a、miR-765、miR-23a、miR-342-3p和miR-126過表達，而let-7c和miR-144表達低于正常組織［40］。

4 展望

目前對miRNA的研究還遠不夠深入，許多奧秘有待探索。隨著研究的不斷展開和深入，對于卵巢中表達的miRNA，如何參與卵巢功能調控，以及調控靶基因預測，以及利用多種分析手段研究miRNA與卵巢疾病之間的關系，為miRNA在干預生殖與發(fā)育調節(jié)、治療生殖相關疾病、輔助生殖等領域提供新策略，也為不孕不育患者帶來新的希望。

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