關(guān)菲菲，張 旭，陳 煒，董 偉，高 凱，張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

瘦素(leptin)是一個主要由白色脂肪組織分泌的細胞因子［1］，其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的瘦素受體結(jié)合能夠啟動調(diào)節(jié)攝食和機體能量平衡，當瘦素缺失或者受體缺失，會導(dǎo)致肥胖發(fā)生［2］。瘦素曾經(jīng)被期望作為一種治療肥胖的藥物，但研究發(fā)現(xiàn)，其僅對于本身缺少瘦素或者脂肪代謝障礙的個體有效，而普通的肥胖患者，由于產(chǎn)生瘦素抵抗，而失去功效［3－6］。盡管對瘦素的研究已經(jīng)開展了很多年，但是很多機制還有待闡明，包括對免疫、神經(jīng)等方面的調(diào)節(jié)，特別是對人類而言，如脂肪組織合成和釋放瘦素的生理調(diào)控，瘦素與胰島素的關(guān)系［7］，瘦素抵抗等［8－10］，該基因仍然是研究的熱點之一。由于大鼠的生理和解剖特點，其在生理、代謝、神經(jīng)系統(tǒng)等方面比小鼠有更好的表現(xiàn)［11，12］。所以，建立leptin敲除大鼠可以用于代謝、神經(jīng)系統(tǒng)研究，有助于更好的理解該基因的功能和參與疾病發(fā)生的機制。大鼠的ES細胞全能性不好，使基于大鼠ES細胞的傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)在大鼠的基因敲除中仍然沒有商業(yè)化。隨著鋅指酶(ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)等技術(shù)的不斷完善，使大鼠基因敲除實用化［13－15］。TALENs是由來自于植物病原菌黃單孢菌的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子(Tale)和核酸內(nèi)切酶Fok I的催化區(qū)域融合而成的融合基因，保留了類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)因子DNA特意識別功能和Fok I的DNA酶活性，識別特異的DNA序列并將其剪切形成雙鏈缺口，通過非同源末端連接修復(fù)該缺口造成 DNA 片 斷 的 插 入 或 缺 失［16－18］。TALENs 與ZFN相比具有識別位點更廣泛和剪切效率更高的優(yōu)點［19］。

本文報告了利用TALENs技術(shù)建立了leptin基因敲除的SD大鼠品系，并對該基因敲除大鼠進行了體重、脂肪含量、糖代謝等分析。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(SCXK(軍)2007－004)，在本實驗室無特定病原體(specific－pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間(SYXK(京)2009－0003)飼養(yǎng)，本實驗方案已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為 ILAS－GC－2012－001。

1.2 TALENs載體的構(gòu)建和體外轉(zhuǎn)錄

左右靶點的識別模塊經(jīng)golden gate方法組裝完成后，分別克隆到真核表達載體pST1374和pC3．1－Huang上完成TALENs載體對的構(gòu)建。線性化后，在T7啟動子的作用下體外轉(zhuǎn)錄為mRNA(AM1345，Ambion)用于大鼠的原核注射。注射用的兩種mRNA經(jīng)注射緩沖液稀釋為終濃度20 ng/μL。剪取經(jīng)原核注射產(chǎn)生的5～7日齡首建鼠的鼠尾組織，提取基因組DNA，利用引物擴增目的片段，PCR上游 引 物 s1 為:5＇－GAAGGTGAGAAGGAGAGAGG CAG－3＇，下游引物 a1 為:5＇－GGTGGAACACGGAGG GGAC－3＇，對擴增出的PCR產(chǎn)物過柱純化(D822A，Takara)，取200 ng純化后的PCR產(chǎn)物，經(jīng)T7EN1酶切，2%瓊脂糖電泳，選擇能夠被酶切開的PCR產(chǎn)物進行TA克隆，測序，與野生型SD大鼠基因目的序列比對，分析靶點序列缺失情況。

1.3 Leptin敲除大鼠的PCR檢測方法

利用兩對引物s2，a2和s3，a3，鑒定 leptin敲除大鼠的基因型，上游引物 s2:5＇－GGAAGCCTCGC TCTACTCCACA－3＇，下 游 引 物 a2:5＇－GTCCTGG AAGCCTCGCTCTGA－3＇，擴增條帶 501 bp;上游引物s3:5＇－TGTGCAGATGTAGCCTTCATGGTG－3＇，下游引物 a3:5＇－GTCCTGGAAGCCTCGCTCTGA－3＇，擴增條帶493 bp;如果鼠尾基因組PCR僅擴增出501 bp條帶，為野生型(+/+);僅擴增出493 bp條帶，為純合子(－/－);若同時擴增出501 bp和493 bp條帶，則是雜合子(+/－)。

1.4 體重及脂肪重量測定

從4周齡開始，每周定期測定大鼠體重，到4月齡時，2%戊巴比妥納麻醉犧牲大鼠，小心剝離皮下脂肪和腹腔脂肪，并稱重。

1.5 血生化指標測定

大鼠禁食過夜，收集外周血，室溫放置1．5 h后，3 000 r/min，15 min，4°離心，獲取血清，利用血生化分析儀(Hitachi 7100 Automatic Analyzer)進行甘油三酯、膽固醇、高密度膽固醇及低密度膽固醇的測定。

1.6 腹腔葡萄糖耐受實驗及葡萄糖刺激下的胰島素水平

待測大鼠稱重，禁食過夜(不禁水)，腹腔注射40%葡萄糖溶液(1 mg/g)，注射前剪尾測定血糖值，計為0時，并分別在注射后第30、60、90、120分鐘測定血糖值。血糖值是利用穩(wěn)豪血糖儀測定。在以上測定時間點，測定血糖的同時，采集100 μL外周血，室溫放置1．5 h 后，3 000 r/min，15 min，4℃離心，獲取血清，利用大鼠/小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒(Millipore)測定血清中胰島素含量。

1.7 MRI成像

MRI成像采用Varian公司生產(chǎn)的7T/160 mm孔徑的小動物磁共振成像系統(tǒng)，將動物用2%異氟烷與氧氣混合氣進行麻醉，用體線圈進行采集和接收，采集過程中用呼吸門控控制信號的采集［20］。選擇SE(自旋回波序列)T1WI分別對leptin－/－大鼠和leptin+/+大鼠進行冠狀位和橫斷位掃描。冠狀位掃描參數(shù):TR(重復(fù)時間)/TE(回波時間)230 ms/16 ms;FOV(視野)70 mm×45 mm;層厚1 mm;層間距1 mm;疊加次數(shù)4;掃描矩陣256×256;總掃描時間3 min 55 s。橫斷位掃描參數(shù):FOV40 mm×45 mm，其它參數(shù)相同。

1.8 組織學(xué)觀察

2%戊巴比妥鈉麻醉犧牲大鼠，打開腹腔取出胰腺將其固定在10%中性甲醛溶液中24 h，脫水，石蠟包埋及切片，HE染色后顯微鏡下觀察(Leica顯微鏡，德國)病理學(xué)變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Leptin敲除大鼠的構(gòu)建及PCR鑒定

根據(jù)大鼠leptin核酸序列信息，針對外顯子3設(shè)計兩處相鄰(間隔20個堿基)的靶序列進行TAL識別模塊構(gòu)建，將這兩個相鄰靶點識別模塊融合克隆到 FokI的 N－末端，形成真核表達載體，得到TALENs質(zhì)粒對(圖1a)。將TALENs質(zhì)粒對共同原核注射到SD大鼠的0．5 d受精卵中，移植到SD假孕鼠子宮內(nèi)，共出生11只幼仔，剪取5～7日齡的鼠尾組織，提取基因組DNA，PCR擴增，測序與野生型大鼠瘦素基因序列比較，其中一個首建大鼠在leptin編碼區(qū)418～425位共8個堿基的缺失，產(chǎn)生了TGA終止密碼子(圖1b)，導(dǎo)致該蛋白C末端缺失了28個氨基酸(圖1c)。雜合子大鼠leptin+/－互交得到純合敲除大鼠leptin－/－(圖1d)。

圖1 Leptin－/－大鼠的TALEN設(shè)計及PCR鑒定Fig．1 Design and assay of TALENs that target the rat leptin locus and their PCR verification

圖2 Leptin－/－大鼠的體重曲線及脂肪分布Fig．2 The body weight curves of leptin－/－ rats and the quantitative analysis of fat tissue

2.2 Leptin敲除大鼠的體重曲線及脂肪分布

從出生后4周齡始至4月齡，測定leptin+/+和leptin－/－大鼠的體重。從5周齡開始，leptin－/－大鼠體重顯著高于leptin+/+大鼠，2月齡時，體重比leptin+/+大鼠增加35%，到4月齡時，比leptin+/+大鼠增加52%(圖2a)。麻醉處死4月齡大鼠，剝離皮下及腹腔脂肪并稱重，證實Leptin－/－大鼠的皮下和腹腔脂肪的重量分別是leptin+/+大鼠的20倍和4倍(圖2b)。MRI結(jié)果也觀察到leptin－/－大鼠皮下和腹腔脂肪積累的增加(圖2c)。同時，leptin－/－大鼠的血清中甘油三酯和膽固醇含量分別是leptin+/+大鼠的8．4倍和1．8倍(表1)。

表1 4月齡leptin－/－大鼠和leptin+/+大鼠的基礎(chǔ)血生化(n=5)Tab．1 Blood biochemical parameters of the leptin－/－ and leptin+/+rats(n=5)

2.3 Leptin敲除大鼠的糖耐受曲線及葡萄糖刺激的胰島素水平曲線

4月齡時，對leptin－/－大鼠進行糖耐受實驗，分別在注射葡萄糖后的第30、60、90、120分鐘采血，測定血糖值和胰島素含量。測定結(jié)果顯示:在過夜空腹16 h后，leptin－/－大鼠和leptin+/+大鼠的空腹血糖差異沒有顯著性，以此數(shù)值記為0 min取值，隨后按體重腹腔注射葡萄糖，發(fā)現(xiàn)在注射后的第60分鐘，leptin－/－大鼠的血糖比leptin+/+大鼠增加了 65%(13．4 ± 1．7 mmol/L vs．8．1 ± 1．4 mmol/L)(P ＜0．05)，第90分鐘，血糖比leptin+/+大鼠增加了85%(12．4 ±1．6 mmol/L vs．6．7 ±0．9 mmol/L)(P＜0．05)，第 120分鐘時，血糖比 leptin+/+大鼠增加了77%(11．0 ±1．5 mmol/L vs．6．2±0．2 mmol/L)(P ＜0．01)(圖 3a)。相應(yīng)時間點的血清胰島素含量顯示，空腹0時，leptin－/－大鼠胰島素含量是 leptin+/+大鼠的 39倍(11．8±1．2 ng/mL vs 0．3 ±0．1 ng/mL)(P ＜0．001)，具有明顯的高胰島素血癥，當注射葡萄糖后的第30分鐘，leptin－/－大鼠胰島素含量是leptin+/+大鼠的7．9 倍(19．3 ±1．6 ng/mL vs．2．4 ± 0．4 ng/mL)(P＜0．001)，第60 分鐘，是 leptin+/+大鼠的17．6 倍(21．1 ± 3．0 ng/mL vs．1．2 ± 0．3 ng/mL)(P ＜0．001)，第 90分鐘，是 leptin+/+大鼠的 20倍(22．4 ± 0．9 ng/mL vs．1．1 ± 0．2 ng/mL)(P ＜0．001)，第 120分鐘，是 leptin+/+大鼠的 22倍(22．8 ± 3．4 ng/mL vs．0．9 ± 0．2 ng/mL)(P ＜0．01)(圖3b)。將2月齡大鼠麻醉處死，取胰腺，4%中性甲醛溶液固定后，石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)leptin敲除純合子大鼠的胰腺組織里有明顯增生的胰島(圖3c，d)，這可能是敲除大鼠有明顯高胰島素血的原因(圖3見封三)。

3 討論

Leptin是由obese(ob)基因編碼，分子量為16 kD的一種細胞因子，主要由白色脂肪組織分泌，在飲食調(diào)節(jié)、能量平衡、糖和脂類代謝、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)再生、血管愈合、癌癥發(fā)生等多方面起到重要作用，參與包括糖尿病、心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥、阿爾茨海默癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［21－24］。截止到2012 年底，已有 22 000 篇文獻對leptin的多種生物學(xué)功能進行了報道［25］。盡管如此，有些作用仍不明確，如體外實驗證實，leptin是脂肪組織中巨噬細胞聚集的趨化劑，增加了前炎癥因子的分泌，引起了脂肪組織的炎癥，這種作用是通過 leptin受體完成的［26，27］，然而體內(nèi)試驗否定了這個作用，試驗者未觀察到高脂飼料飼喂下leptin受體缺失的小鼠與正常小鼠脂肪組織中的巨噬細胞的差異［28］。由于leptin對機體的重要作用，構(gòu)建leptin缺失的動物模型將有助于更好的揭示其作用機制。

1949年美國杰克遜實驗室發(fā)現(xiàn)的一種隱性遺傳的leptin自發(fā)突變小鼠(ob/ob)，是在基因編碼區(qū)的第105位發(fā)生了C到T的無義突變，蛋白在C末端缺失了133個氨基酸。突變基因純合子小鼠表現(xiàn)為攝食過度、肥胖、葡萄糖耐受、高血漿胰島素水平、不孕不育［29－30］。

2012年，Serglo Valra等［31］利用 ZFN 技術(shù)獲得了一種leptin敲除大鼠，是在該基因外顯子1和內(nèi)含子上發(fā)生了151個堿基片斷的缺失，leptin蛋白無法正常表達。該純合子大鼠出現(xiàn)攝食增加，肥胖，血清中總膽固醇、高密度和低密度膽固醇顯著增加，有明顯的高胰島素血和糖耐受受損。

本實驗室利用TALENs技術(shù)獲得了一種leptin基因敲除大鼠，測序發(fā)現(xiàn)是在leptin基因編碼區(qū)的第418～425位有8個堿基的缺失(外顯子3)，并形成了TGA終止子，蛋白C末端缺失了28個氨基酸。該leptin－/－大鼠5周齡時體重顯著高于leptin+/+大鼠，4月齡時，體重比野生大鼠增加達52%，脂肪大量積累在皮下和腹腔中，且皮下脂肪積累更多，血清中甘油三酯和總膽固醇含量較野生大鼠顯著增加，leptin－/－大鼠的血清中甘油三酯和總膽固醇含量分別是 leptin+/+大鼠的8．4倍和1．8倍，并有明顯的糖耐受受損和高胰島素血。該敲除大鼠的獲得說明了C末端28個氨基酸序列對于leptin行使功能非常重要。由于leptin在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)再生、血管愈合、癌癥發(fā)生等多方面的重要作用，該大鼠預(yù)期可以成為肥胖、糖尿病、高血脂等疾病模型，也可以更好的探討leptin在神經(jīng)、免疫、癌癥等方面的作用。

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