徐艷峰，侯粉霞，楊慧芳

(1．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級實(shí)驗(yàn)室北京 100021;2．中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室最近開展的一項(xiàng)Wistar大鼠慢性毒性與致癌合并試驗(yàn)，本文對試驗(yàn)中對照組的各種非腫瘤病變進(jìn)行報(bào)道，提供經(jīng)過2年喂飼后(109周齡)Wistar大鼠各種非腫瘤病變的發(fā)生率。由于對照組動(dòng)物未經(jīng)染毒和任何人為干預(yù)，認(rèn)為其發(fā)生的非腫瘤病變屬于自發(fā)性非腫瘤病變。本文可為相關(guān)技術(shù)人員提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Wistar大鼠(4周齡)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK-(京)2006-0009;經(jīng)隨機(jī)分組后對照組有雄性和雌性大鼠各60只。試驗(yàn)前觀察1周，之后開始試驗(yàn)。

1.2 飼養(yǎng)條件

動(dòng)物飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，屏障環(huán)境，許可證號為SYXK(京)2009-0032;每籠5只。雄性動(dòng)物于試驗(yàn)的第14周調(diào)整為每籠3只，雌性動(dòng)物于試驗(yàn)的第37周調(diào)整為每籠4只。動(dòng)物自由飲水和攝食。對照組喂飼常規(guī)飼料，每2～4周制備一次飼料?？瓢膮f(xié)力飼料有限公司負(fù)責(zé)制備飼料，其合格證號為SCXK(京)2009-0012。

1.3 組織病理學(xué)檢查

試驗(yàn)期為104周。試驗(yàn)結(jié)束后(109周齡)，對照組存活雄性大鼠35只、雌性大鼠33只。安樂死方法處死動(dòng)物，先腹腔注射10%水合氯醛水溶液(3 mL/kg體重)麻醉動(dòng)物，股動(dòng)脈放血處死后進(jìn)行大體解剖。將下列組織用4%甲醛溶液固定，供進(jìn)一步組織病理學(xué)檢查:心、肝、肺、腎、脾、腦、脊髓、氣管、食管、胰腺、胃、腸(十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸)、腎上腺、垂體、甲狀腺(包括甲狀旁腺)、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓、眼球、睪丸、附睪、前列腺、卵巢、子宮、乳腺等臟器。取固定的組織和器官，經(jīng)脫水后石蠟包埋、切片5 μm、HE染色、光學(xué)顯微鏡檢查。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所病理室負(fù)責(zé)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并對各種病變發(fā)生率進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 雄性大鼠的自發(fā)性非腫瘤病變

表1 109周齡Wistar大鼠自發(fā)性非腫瘤病變及其發(fā)生率Tab．1 Spontaneous non-neoplastic lesions and their incidences in the 109-week-old Wistar rats

續(xù)表

雄性大鼠的自發(fā)性非腫瘤病變主要為慢性進(jìn)行性腎病、心肌病、膽管增生、睪丸萎縮、睪丸動(dòng)脈炎、胃腺體擴(kuò)張、角膜炎和肺泡腔內(nèi)泡沫細(xì)胞聚集等，其發(fā)生率分別為60%、40%、31.43%、11.43%、17.14%、20%、20%和14.29%。其他病變的發(fā)生率均不超過10%(表1)。

2.2 雌性大鼠的自發(fā)性非腫瘤病變

雌性大鼠的自發(fā)性非腫瘤病變主要為肝臟膽管增生、腎上腺血管擴(kuò)張、腎上腺皮質(zhì)局灶狀肥大、腎臟腎小管擴(kuò)張及再生、心肌病和胃腺體擴(kuò)張等，其發(fā)生率分別為 36.36%、27.27%、12.12%、21.21%、15.15%和15.15%。其他病變的發(fā)生率均不超過10%(表1)。

3 討論

根據(jù)《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》(GB 15670-1995)，大鼠慢性毒性試驗(yàn)或大鼠慢性毒性與致癌合并試驗(yàn)中，大鼠需要進(jìn)行為期2年的染毒。試驗(yàn)結(jié)束后動(dòng)物已進(jìn)入老年期，在進(jìn)行慢性毒性評價(jià)時(shí)，需要區(qū)別組織病理學(xué)檢查所觀察到的病變是染毒相關(guān)的病變還是動(dòng)物的自發(fā)病變，這主要通過統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)進(jìn)行判斷;與對照組相比，如果高劑量組病變發(fā)生率增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，則可考慮病變的發(fā)生與染毒具有相關(guān)性。然而，在每組動(dòng)物數(shù)不變的情況下，如果對照組動(dòng)物病變(自發(fā)性病變)發(fā)生率很高，則可降低統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)的效率，掩蓋受試物所引起的病變發(fā)生率的增高，干擾對研究結(jié)果的準(zhǔn)確評價(jià)。因此，動(dòng)物自發(fā)性非腫瘤病變的發(fā)生率對于評價(jià)慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果具有重要的參考價(jià)值。

在本研究中，僅雄性大鼠自發(fā)性慢性腎病發(fā)生率達(dá)到了60%，與下列一些報(bào)道中的自發(fā)性病變相比，雄性和雌性動(dòng)物其他病變的發(fā)生率均相對較低。在尹紀(jì)業(yè)等的報(bào)道［1，2］中，對照組F334大鼠喂飼24個(gè)月后，腎臟、肺臟、心臟和肝臟等主要臟器病變的發(fā)生率為65.9%(29/44)～90.9%(40/44)，遠(yuǎn)高于本研究中的發(fā)生率。在Mann SW的研究［3］中，對照組大鼠慢性腎病發(fā)生率雄性為68%、雌性為44%，肝細(xì)胞脂肪空泡變性雄性為18%、雌性為38%，心肌炎雄性為54%、雌性為24%，腎上腺皮質(zhì)出血變性雄性為6%、雌性為58%。在Quast JF的研究［4］中，對照組雄性大鼠的肝臟、腎臟和心臟病變發(fā)生率低于本研究中的發(fā)生率，但雌性大鼠腎上腺皮質(zhì)變性發(fā)生率為85%(68/80)、心臟病變?yōu)?3.8%(59/80)、子宮血鐵質(zhì)色素沉積為62.5%(50/80)。此外，本研究以及上述的報(bào)道中，均存在腎上腺自發(fā)性病變的發(fā)生率雌性明顯高于雄性的情況。

隨著大鼠年齡的增長，自發(fā)性病變逐漸增多。8周齡大鼠的各種自發(fā)性病變發(fā)生率基本小于5%［5］;32-38周齡Wistar大鼠的自發(fā)性病變發(fā)生率以脾臟、肝臟、腎臟、肺臟和心臟等臟器較高，分別為 59.1%、50%、47.5%、29.1% 和 21.7%［6］。SD大鼠在試驗(yàn)期12個(gè)月后，對照組雄性和雌性大鼠慢性間質(zhì)性腎炎的發(fā)生率均為100%(10/10)，雄性大鼠心肌病的發(fā)生率為30%(3/10)、雌性大鼠胰腺局部萎縮的發(fā)生率為50%(5/10)，對照組其他病變的發(fā)生率均為0［7］。SPF級對照組Wistar大鼠在試驗(yàn)期18個(gè)月后發(fā)生率高的自發(fā)病變?yōu)樾坌源笫蟾文懝茉錾?10/19)、腎小管堿性變(10/19)和腎小管透明 管 型 (8/19)［8］。 經(jīng) 濟(jì) 合 作 和 發(fā) 展 組 織(Orgnization for Economic Cooperation and Development，OECD)要求大鼠慢性毒性試驗(yàn)的染毒期為12 個(gè)月(OECD TG452［9］和 TG453［10］)，少于或多于12個(gè)月時(shí)都應(yīng)說明理由。我國大鼠慢性毒性試驗(yàn)的染毒期為2年，考慮到老年大鼠自發(fā)病變的發(fā)生率高且可能影響試驗(yàn)結(jié)果的判斷，其科學(xué)性和合理性有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究論證和商榷。

在不同實(shí)驗(yàn)室，大鼠喂飼2年后各種自發(fā)性病變的發(fā)生率會有一定差別，這可能與所采用的大鼠的品系、批次、動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境條件、動(dòng)物管理、試驗(yàn)人員態(tài)度和技術(shù)水平、病理診斷標(biāo)準(zhǔn)等因素有關(guān)。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意建立自己的歷史對照值，為進(jìn)一步開展大鼠慢性毒性試驗(yàn)提供技術(shù)支撐。本文報(bào)告了SPF級Wistar大鼠各種自發(fā)性非腫瘤病變的發(fā)生率，以期為有關(guān)技術(shù)人員提供參考。

［1］ 尹紀(jì)業(yè)，董延生，袁本利，等．F344大鼠常見非增殖性病變病理學(xué)觀察［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21(6):26－28．

［2］ 尹紀(jì)業(yè)，董延生，袁本利，等．F344大鼠4種飲用水飼養(yǎng)2年實(shí)驗(yàn)病理學(xué)觀察［J］．軍事醫(yī)學(xué)，2012，36(7):535－538．

［3］ Mann SW，Yuschak MM，Amyes SJ，et al．A combined chronic toxicity/carcinogenicity study of sucralose in Sprague-Dawley rats［J］．Food Chem Toxicol，2000，38(Suppl 2):S71 －89．

［4］ Quast JF． Two-yeartoxicity and oncogenicity study with acrylonitrile incorporated in the drinking water of rats［J］．Toxicol Lett，2002，132(3):153 －196．

［5］ 汪會玲，楊華，于洲，等．不同品系清潔級8周齡大鼠腎臟常見病理變化及其自發(fā)率［J］．衛(wèi)生研究，2006，35(3):351－352．

［6］ 孫衍慶，李軍，左從林．Wistar大鼠各臟器自發(fā)性病變的組織病理性觀察［J］．中國藥理通訊，2004，21(4):27－28．

［7］ Johannsen FR，Levinskas GJ．Comparative chronic toxicity and carcinogenicity ofacrylonitrile by drinking waterand oral intubation to Spartan Sprague-Dawley rats ［J］．Toxicol Lett，2002，132(3):197－219．

［8］ Takagi A，Sekita K，Saitoh M，et al．Acute，subchronic and chronic toxicity studies of a synthetic antioxidant，2，2 ＇－isobutylidenebis(4，6-dimethylphenol)in rats［J］．J Toxicol Sci，2005，30(4):275 －285．

［9］ OECD．OECD guideline for the testing of chemicals:Chronic Toxicity Studies［M］．Adopted on 7th September 2009:7．

［10］ OECD．OECD guideline for the testing of chemicals:Combined Chronic ToxicityCarcinogenicity Studies［M］．Adopted on 7th September 2009:8．