蔣冬花，高愛同，畢 珂，謝祥聰，陳 璨

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

小米是我國北方的主要小雜糧之一，具有“百谷之首”的美譽.小米糠是小米加工過程的副產(chǎn)品，占小米質(zhì)量的6%～8%.按照我國小米年產(chǎn)量500 萬t 計算，每年加工小米將產(chǎn)生小米糠40 萬t 左右.研究表明，小米糠中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)素，以及生育酚、亞油酸、γ-谷維醇、植物甾醇、神經(jīng)酰胺等生理活性物質(zhì).因此，小米糠在國外被譽為“天賜營養(yǎng)源”［7-8］.在我國，小米糠絕大多數(shù)被用作低附加值的禽獸飼料或提取小米糠油［9］，利用率頗低，深加工產(chǎn)品較少，未將其所具有的營養(yǎng)價值和資源效益充分發(fā)揮，浪費了這一大自然資源.聯(lián)合國工業(yè)發(fā)展組織稱其為“一種未充分利用的工業(yè)原料”［10］.目前，已有發(fā)酵稻米糠生產(chǎn)GABA 的研究報道［11-12］，但以小米糠為培養(yǎng)基原料、通過乳酸菌發(fā)酵合成GABA 的研究尚未見報道.

乳酸菌是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌，有幫助消化、有助于人體腸道健康等功能，常被視為健康食品.因此，利用乳酸菌生產(chǎn)的GABA 能達到食品安全級，并可進一步豐富乳酸菌作為益生菌的保健功效，具有廣闊的應(yīng)用范圍和市場前景［4，13］.

本研究以廉價的農(nóng)副產(chǎn)品小米糠為原料，L-谷氨酸鈉(L-MSG)為合成底物，通過短乳桿菌(Lactobacillus brevis)L2 菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA.為有效利用小米糠這一農(nóng)副產(chǎn)品資源提供一種新方式，也為GABA 的生產(chǎn)提供一種新方法.

1 材料與方法

1.1 菌種及小米糠

短乳桿菌(Lactobacillus brevis)L2 菌株，由本實驗室從酸菜［13］中篩選，其特點為高產(chǎn)GABA.該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為:CCTCC NO:M 209132.

小米糠:由山東省濟寧市金鄉(xiāng)國昌果蔬有限公司提供.

1.2 培養(yǎng)基

1)瓊脂試管斜面培養(yǎng)基:酵母膏10 g，葡萄糖15 g，碳酸鈣15 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.50.用于L2 菌株的保藏.

自編軟件在水利工程設(shè)計單位科技檔案管理中的應(yīng)用………………………………… 劉文君，單 潔，湯 杰(12.44)

2)改良MRS 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乙酸鈉2 g，檸檬酸二胺2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 6.50.用于L2 菌株的活化.

3)GYP 種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，酵母膏5 g，丁二酸鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.50.用于L2 菌株發(fā)酵種子的制備.

4)不同含量小米糠培養(yǎng)基:小米糠10～80 g/L，L-谷氨酸鈉20～60 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 4.00.用于L2 菌株發(fā)酵合成GABA.

1.3 主要儀器設(shè)備與試劑

Universal 32R 臺式高速冷凍離心機(德國Hettich 公司);Milli-Q Academic A10 超純水系統(tǒng)(美國Millipore 公司);PB-10 pH 酸度計(德國Sartorius 公司);LRH-250 生化培養(yǎng)箱(上海一恒公司);PB-10 電子天平(德國Sartorius 公司);SA-960-2 生物潔凈工作臺(上海上凈凈化設(shè)備有限公司);1200 型高效液相色譜儀(美國Aglient 公司);Kromasil C18高效液相色譜柱(美國Thermo公司).

GABA 標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma 公司);丹磺酰氯(美國Fluka Chemie AG 公司).所用藥品試劑均為分析純，乙腈為色譜純.

1.4 菌株的活化和發(fā)酵種子的制備

從冰箱中取出L2 菌株試管斜面保存菌種，室溫靜置1 h，從斜面上取2 環(huán)菌體接入50 mL 改良MRS 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜止活化培養(yǎng)16 h.取一環(huán)菌種轉(zhuǎn)接到GYP 種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h用作發(fā)酵種子.

1.5 發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化

1.5.1 培養(yǎng)基初始pH 的優(yōu)化

將小米糠培養(yǎng)基(小米糠50 g/L，L-谷氨酸鈉20 g/L)用1 mol/L 碳酸氫鈉溶液和1 mol/L 檸檬酸溶液調(diào)成不同的培養(yǎng)基，初始pH 值分別為3.00，3.60，4.00，4.40，4.60，4.80，5.00，5.20，5.40，5.60，5.80，6.00 和6.20，然后按體積比3%接種量接入種子液，30 ℃靜止培養(yǎng)24 h，用高效液相色譜儀測定發(fā)酵液中GABA 的含量.

1.5.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

將小米糠培養(yǎng)基(同上)初始pH 調(diào)成4.00，按體積比3%接種量接入種子液，分別在4，10，20，30，40，50，60 和70 ℃共8 個溫度下靜置培養(yǎng)24 h，用高效液相色譜儀測定發(fā)酵液中GABA 的含量.

1.5.3 培養(yǎng)時間的確定

將小米糠培養(yǎng)基(同上)初始pH 調(diào)成4.00，按體積比3%接種量接入種子液，30 ℃靜止培養(yǎng)108 h，期間每6 h 取樣測定發(fā)酵液pH 變化和GABA 的含量.

1.5.4 底物L(fēng)-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度的優(yōu)化

將含不同質(zhì)量濃度L-谷氨酸鈉的小米糠培養(yǎng)基(含小米糠50 g/L，L-谷氨酸鈉分別為20，30，40，50 和60 g/L)初始pH 調(diào)成4.00，按體積比3%接種量接入種子液，30 ℃靜止培養(yǎng)72 h，用高效液相色譜儀測定含不同質(zhì)量濃度L-谷氨酸鈉發(fā)酵液中GABA 的含量.

1.5.5 小米糠加入量的優(yōu)化

將種子液以體積比3%的接種量接種到不同含量小米糠培養(yǎng)基(小米糠添加量為10～80 g/L，L-谷氨酸鈉50 g/L，初始pH 4.00)中，30 ℃靜止培養(yǎng)72 h，用高效液相色譜儀測定含不同加入量小米糠發(fā)酵液中GABA 的含量.

1.6 GABA 定量分析

用高效液相色譜(HPLC)法測定GABA 的產(chǎn)量.具體操作方法如下:發(fā)酵液5 000 r/min 離心后，上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取10 μL 于2.5 mL 離心管中，加入衍生緩沖液100 μL、衍生劑(2，4-二硝基氟苯)100 μL 和定容緩沖液790 μL，混勻，60 ℃水浴1 h，20 μL 進樣.色譜條件為:流動相由流動相A 與流動相B 按體積比為2 ∶1組成，流動相A 為乙酸鈉溶液和水，流動相B為乙腈;流速為0.5 mL/min;柱溫為室溫;色譜柱為Kromasil C18柱;檢測波長為338 nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基初始pH 對L2 菌株GABA 合成的影響

在pH 3.00～6.20 設(shè)置了13 個小米糠培養(yǎng)基初始pH，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，分別檢測產(chǎn)物GABA和底物L(fēng)-谷氨酸鈉含量的變化，結(jié)果如圖1所示:L2 菌株在pH 3.00～6.20 均能發(fā)酵產(chǎn)生GABA，但pH 對GABA 的產(chǎn)量有顯著的影響.在pH 3.00～4.00，隨著pH 值的增大，GABA 的產(chǎn)量快速升高;當(dāng)pH 值大于4.00 時，隨著pH 值的增大，GABA 的產(chǎn)量又逐漸降低.底物L(fēng)-谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度的變化與之相反.pH 值小于3.00 及大于6.20 時，GABA的產(chǎn)量均很低.在pH 值為4.00時，GABA 的產(chǎn)量達到最大值，為10.316 g/L.表明偏酸性環(huán)境較適宜L2 菌株合成GABA.

圖1 初始pH 對小米糠培養(yǎng)基上L2 菌株產(chǎn)GABA 的影響

2.2 培養(yǎng)溫度對L2 菌株GABA 合成的影響

培養(yǎng)溫度對短乳桿菌L2 菌株GABA 合成的影響見圖2.L2 菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA 的溫度以30 ℃為宜.

圖2 培養(yǎng)溫度對小米糠培養(yǎng)基上L2 菌株產(chǎn)GABA 的影響

2.3 培養(yǎng)時間對L2 菌株GABA 合成的影響

培養(yǎng)時間對短乳桿菌L2 菌株發(fā)酵液pH 及GABA 合成的影響見圖3.隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液pH 值在0～12 h 略有減小;但隨著GABA的合成，發(fā)酵液pH 值逐步增大;在發(fā)酵72 h 時，發(fā)酵液對應(yīng)的pH 值和GABA 的含量分別為6.41及28.247 g/L.當(dāng)發(fā)酵液pH 值大于6.20 時，已不適合GABA的合成.因此，適宜的發(fā)酵時間確定為66～72 h.

圖3 培養(yǎng)時間對小米糠培養(yǎng)基pH及L2 菌株產(chǎn)GABA 的影響

2.4 L-谷氨酸鈉含量對L2 菌株GABA 合成的影響

L-谷氨酸鈉含量對短乳桿菌L2 菌株GABA合成的影響見圖4.隨著L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度的增加，GABA 的產(chǎn)量也逐漸提高.當(dāng)L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為50 g/L 時，GABA 的產(chǎn)量達到最高.L2菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA 適宜的底物L(fēng)-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為50 g/L.

圖4 不同含量L-谷氨酸鈉對小米糠培養(yǎng)基上L2 菌株產(chǎn)GABA 的影響

2.5 小米糠添加量對L2 菌株GABA 合成的影響

不同含量小米糠培養(yǎng)基(小米糠添加量為10～80 g/L，L-谷氨酸鈉50 g/L，初始pH 4.00)對L2 菌株GABA 合成的影響見圖5.隨著小米糠添加量的增加，GABA 的產(chǎn)量也逐漸提高.當(dāng)小米糠含量達到70 g/L 時，GABA 的產(chǎn)量達最高，為32.037 g/L.

圖5 小米糠添加量對L2 菌株產(chǎn)GABA 的影響

圖6 發(fā)酵液中GABA 的高效液相色譜圖

圖7 發(fā)酵液中純化的GABA 透明針狀結(jié)晶

發(fā)酵液經(jīng)高效液相色譜分析GABA，代表性圖譜見圖6.發(fā)酵液經(jīng)分離純化、洗脫、濃縮和結(jié)晶等步驟后，可得GABA 透明針狀結(jié)晶(見圖7).

3 討論

本研究以廉價的農(nóng)副產(chǎn)品小米糠為原料，L-谷氨酸鈉(L-MSG)為合成底物，通過短乳桿菌(Lactobacillus brevis)L2 菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA.將小米糠這一農(nóng)副產(chǎn)品作為乳酸菌培養(yǎng)基進一步開發(fā)利用，相對于常規(guī)乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA 使用的MRS 發(fā)酵培養(yǎng)基［6］，小米糠培養(yǎng)基具有配方簡單(只含有小米糠和底物L(fēng)-谷氨酸鈉)、原料價格低廉、純天然、無污染等優(yōu)點，大大地降低了生產(chǎn)成本，從而增強了工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟可行性和市場競爭力，對于用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA 的產(chǎn)業(yè)化具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊前景，并為有效利用小米糠這一農(nóng)副產(chǎn)品資源提供了一種新的方式;將小米糠開發(fā)為富含GABA 的保健功能食品，對減少資源浪費，提高農(nóng)產(chǎn)品附加值具有重要意義.

本研究通過單因子實驗優(yōu)化了小米糠培養(yǎng)基上L2 菌株發(fā)酵生產(chǎn)GABA 的過程中pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、小米糠及底物添加量等因素，獲得了優(yōu)化培養(yǎng)基組分為:小米糠70 g/L，L-谷氨酸鈉50 g/L，優(yōu)化發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH 4.00，30 ℃培養(yǎng)66～72 h.在優(yōu)化的培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件下，發(fā)酵液中GABA 的產(chǎn)量可達32.037 g/L.該產(chǎn)量屬于目前國內(nèi)外生產(chǎn)GABA 較高的產(chǎn)量［4，6］.

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