王長春，張玉梅，楊 玲，胡海濤

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

溫州白銀豆，學(xué)名利馬豆(Phaseolus lunatus L.)，豆科棉豆屬，起源于熱帶美洲，屬喜溫類蔬菜，對低溫脅迫敏感［1］.白銀豆主產(chǎn)于浙江省溫州瑞安市，因其籽粒營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、必需氨基酸，同時含有多種礦物質(zhì)和維生素，而廣受歡迎［2］，已成為當(dāng)?shù)氐囊淮笾еa(chǎn)業(yè).浙江屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，春季天氣回暖過程中常因冷空氣的侵入使氣溫下降到8 ℃甚至5 ℃左右，這種倒春寒天氣會導(dǎo)致白銀豆遭受冷害，輕則產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響，重則受害致死，嚴(yán)重制約了白銀豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.

確定植物的臨界生長低溫是深入研究植物抗冷性機(jī)理及改進(jìn)植物抗冷性的基礎(chǔ).筆者借助電導(dǎo)率法并基于Arrhenius 圖預(yù)估白銀豆幼苗生長的臨界低溫是8 ℃［3］.本文根據(jù)葉綠素含量、光合特性、保護(hù)酶活性與膜脂過氧化的動態(tài)變化，進(jìn)一步證實8 ℃低溫脅迫作為白銀豆幼苗的臨界低溫是合理的.

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)及低溫處理

溫州白銀豆(Phaseolus lunatus L)購自浙江省溫州瑞安市荊谷白銀豆合作社.飽滿白銀豆種子經(jīng)20 g/L 次氯酸鈉溶液消毒15 min，自來水流水浸泡4 h.種子分批播種至砂缽中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28 ℃光照14 h(06:00 -20:00)，光照強度為40 μmol·m-2·s-1，待第一真葉出現(xiàn)時，用1/2 的Hoagland 營養(yǎng)液(pH 5.8)進(jìn)行水培.選取長勢基本一致的白銀豆幼苗，洗凈根部沙子，一株一孔移栽，每隔2 d 更換28 ℃下溫育的營養(yǎng)液.生長約2 周的白銀豆幼苗，第1 片三出復(fù)葉展開時進(jìn)行8 ℃低溫處理，以28 ℃生長的幼苗為對照，分別于處理1，3，6，12 和24 h 時取其第1 片三出復(fù)葉的末端小葉，測定各項指標(biāo).

1.2 葉綠素含量測定

采用分光光度法［4］.

1.3 熒光參數(shù)測定

用LI-6400 和熒光葉室6400-40(美國Li-Cor公司)測定第1 片三出復(fù)葉末端小葉的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)和電子傳遞效率(ETR).

1.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

稱取0.5 g 葉片樣品，在預(yù)冷的4 mL pH 7.8(0.05 mol·L-1)磷酸緩沖溶液中冰浴研磨，于4 ℃下8 000 r/min 離心15 min，取上清液采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定［5］.用UV-1601 型分光光度計測定560 nm 波長下的吸光度，以抑制氮藍(lán)四唑光還原的50%作為1 個酶活性單位.

1.5 過氧化物酶(POD)活性測定

愈創(chuàng)木酚法［5］測定POD 活性.測定系統(tǒng)含20 μL 酶提取液和3 mL 反應(yīng)液(8 μL 愈創(chuàng)木酚、19 μL 30% H2O2溶液)，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液(pH 6.0)定容至50 mL，在470 nm 波長進(jìn)行比色，計算其單位時間內(nèi)吸光度的變化，以1 min內(nèi)A470減少1 的酶量為1 個活性單位.

1.6 丙二醛(MDA)含量測定

硫代巴比妥酸比色法［5］測定MDA 含量.

其中，A450，A532和A600分別代表450，532 和600 nm波長下的吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 8 ℃低溫脅迫對光合特性的影響

2.1.1 低溫脅迫下葉綠素含量的動態(tài)變化

白銀豆幼苗葉綠素含量在8 ℃低溫處理1 h后大幅上升，3 h 時達(dá)最高;6 h 時略有下降，但與3 h 時相比無顯著性差異(P ＜0.05);隨后，含量迅速下降，24 h 與0 h 時含量無明顯差異(見圖1).8 ℃處理1 d 的葉片總?cè)~綠素含量并不低于0 h 時，可能是因為葉片在低溫光照下大量失水，含水量降低速度高于葉綠素分解速度的緣故.

圖1 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗葉綠素含量的變化

2.1.2 低溫脅迫對光化學(xué)效率的影響

光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)對環(huán)境脅迫非常敏感.葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)可以很好地反映PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能變化.最大光化學(xué)效率(Fv/Fm，可變熒光與最大熒光的比值)和電子傳遞速率(ETR)的大小體現(xiàn)了光系統(tǒng)光合能力的大小，是研究植物對逆境響應(yīng)的重要的生理生態(tài)參數(shù).8 ℃低溫處理下，隨時間的延長，白銀豆幼苗葉片的最大光化學(xué)效率逐漸降低，但是在12 h 時有所回升，24 h 后降低到最低值(見圖2);電子傳遞速率持續(xù)下降(見圖3).低溫脅迫使白銀豆葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率下降，潛在活性中心受損，光合作用的原初反應(yīng)受到抑制，導(dǎo)致光抑制產(chǎn)生.低溫脅迫下電子傳遞的受抑，一方面可以將過剩的光能轉(zhuǎn)化成Mehler 反應(yīng)的激發(fā)能，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生;另一方面，以分子態(tài)氧為受體的光合電子傳遞支路反應(yīng)的增強也提高了活性氧的積累量.這些活性氧若不及時清除，必然造成氧化脅迫，引起膜脂過氧化，導(dǎo)致膜系統(tǒng)破壞.

圖2 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗最大光化學(xué)效率的變化

圖3 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗電子傳遞速率的變化

2.2 8 ℃低溫脅迫對白銀豆抗氧化系統(tǒng)的影響

2.2.1 不同脅迫時間下SOD 活性的變化

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)普遍存在的參與氧代謝的一種含金屬酶.由于該酶的活性大小與植物的衰老及抗逆性密切相關(guān)，是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一［6］.如圖4 所示，8 ℃低溫脅迫下，白銀豆葉片的SOD 活性逐漸上升，6 h 達(dá)最大值，后逐漸下降，但都高于0 h 時.SOD 活性的升高，說明白銀豆在8 ℃低溫處理過程中具有維持體內(nèi)活性氧分子產(chǎn)生與清除之間的動態(tài)平衡能力，保護(hù)植物體不受氧化脅迫.

圖4 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗SOD 活性的變化

圖5 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗POD 活性的變化

2.2.2 不同脅迫時間下POD 活性的變化

過氧化物酶(POD)能夠清除逆境條件下由于膜脂過氧化而產(chǎn)生的活性氧自由基，保護(hù)生物膜不受損傷.POD 是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，它與SOD 和過氧化氫酶相互協(xié)調(diào)配合，清除過剩的自由基，使機(jī)體內(nèi)的自由基維持在正常的動態(tài)水平，以提高植物的抗逆性［7］.8 ℃低溫脅迫下，白銀豆葉片中POD 活性先下降、后上升，在3 h 時達(dá)到最大值，隨后有所下降，處理24 h 時又上升達(dá)顯著差異(見圖5).

2.2.3 低溫脅迫下MDA 含量的變化

植物器官衰老或在逆境下遭受傷害時，往往發(fā)生膜脂過氧化作用［8］.常以丙二醛(MDA)含量來反映植物膜脂過氧化的水平和對細(xì)胞膜的傷害程度.從圖6 可以看出，白銀豆葉片MDA 含量于8 ℃低溫處理后先上升，在3 h 時達(dá)最大值，然后逐漸下降，24 h 與0 h 時相比無明顯差異.

2.3 8 ℃處理后白銀豆葉片冷害癥狀的恢復(fù)

表型觀察結(jié)果(見圖7)顯示:白銀豆葉片在8 ℃低溫處理24 h 后失水萎蔫，恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)后癥狀大大緩解，基本恢復(fù)正常;在6 ℃處理24 h 后失水更為嚴(yán)重，葉片皺縮、邊緣卷縮，置正常溫度培養(yǎng)24 h 后不恢復(fù).

圖6 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗MDA 含量的變化

圖7 8 ℃，6 ℃低溫處理前后及恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)后白銀豆葉片的表型觀察

3 討論

細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換的主要通道，是細(xì)胞感受環(huán)境脅迫最敏感的部位［9］.低溫冷害首先損傷細(xì)胞膜半透性，導(dǎo)致電解質(zhì)滲漏率增加.Arrhenius 圖折點對應(yīng)的溫度反映膜脂的相變溫度［10］，指示在此溫度下膜結(jié)合酶活性的驟變及膜半透性的喪失.已有較多學(xué)者采用該法研究植物的抗冷性［10-12］.筆者利用該法確定了白銀豆葉片相對電導(dǎo)率的Arrhenius 圖在8 ℃有一折點，因而視8 ℃為白銀豆幼苗生長的臨界低溫［3］.

單一指標(biāo)不能正確反映植物的抗冷性實質(zhì)，只有綜合評價并采用多種方法印證，才能得出正確的結(jié)論.多數(shù)研究［12-13］表明:低溫使膜系統(tǒng)的流動性降低，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)外滲，水分散失［14］;光合作用減弱，熒光增強;活性氧的產(chǎn)生和清除平衡體系被破壞，自由基(O2-，H2O2等)的增加進(jìn)一步造成生物膜中脂質(zhì)的過氧化或脫脂化［15-16］;植物體為了自我保護(hù)，誘導(dǎo)SOD 等酶的活性增加，以清除活性氧自由基.

白銀豆在8 ℃低溫脅迫初期，SOD 和POD 活性上升，分別于脅迫3 h 和6 h 達(dá)到最大值，與對照相比差異顯著.而MDA 含量在3 h 時上升到最高后逐漸下降，表明8 ℃處理3 h 時植物膜脂過氧化的水平最高，細(xì)胞膜的傷害程度最大，在光合作用方面表現(xiàn)出光合能力的下降，但是在活性氧清除系統(tǒng)的保護(hù)下，活性氧水平逐步下降，MDA含量在24 h 后下降到對照水平，植株抵御了低溫的傷害.此外，白銀豆在8 ℃處理后冷害癥狀可消失，恢復(fù)至處理前狀態(tài)，說明白銀豆在該溫度下具有自我修復(fù)的能力，也印證了生理生化指標(biāo)的準(zhǔn)確性，說明8 ℃作為白銀豆的臨界低溫是合理的.

［1］施寶女.溫州白銀豆［J］.上海蔬菜，2001(3):10.

［2］徐少波，葉禮水，鄭志蘭.大粒利馬豆高產(chǎn)栽培技術(shù)探討［J］.溫州農(nóng)業(yè)科技，1999(2):14-16.

［3］Zhang Y M，Wang C C，Hu H T，et al.Cloning and expression of three fatty acid desaturase genes from cold-sensitive lima bean (Phaseolus lunatus L.)［J］.Biotechnol Lett，2011，33(2):395-401.

［4］李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2004:134-136.

［5］于超.溫度脅迫下番茄內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω-3 脂肪酸去飽和酶基因的表達(dá)和功能研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，2009.

［6］王靜，孫磊，張成軍，等.雜交稻幼苗期對低溫脅迫的生理反應(yīng)［J］.作物學(xué)報，2006，32(7):1049-1056.

［7］Frachebound Y，Haldimann P，Leipner J，et al.Chlorophyll fluorescence as a selection tool for cold tolerance of photosynthesis in maize (Zea mays L.)［J］.Journal of Experimental Botany，1999，50(338):1533-1540.

［8］Dat J，Vandenabeele S，Vranová E，et al.Dual action of the active oxygen species during plant stress responses［J］.Cell Mol Life Sci，2000，57(5):779-795.

［9］Gimalov F R，Baymiev A K，Matniyazov R T，et al.Initial stages of low-temperature induction of cabbage cold shock protein gene csp5［J］.Biochemistry，2004，69(5):575-579.

［10］楊福愉，邢菁如，陳文雯，等.低溫對耐寒與不耐寒玉米線粒體膜的影響［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，1982，14(5):521-524.

［11］楊玲，蘇維埃.磷脂酰甘油的熱致相變與水稻抗冷性［J］.科學(xué)通報，1994，39(16):1522-1525.

［12］Raison J K，Chapman E A.Membrane phase changes in chilling-sensitive Vigna radiata and their significance to growth［J］.Australian Journal of Plant Physiology，1976，3(3):291-299.

［13］Dolstra O，Haalstra S R，van der Putten P E L，et al.Genetic variation for resistance to low-temperature photoinhibition of photosynthesis in maize (Zea mays L.)［J］.Euphytica，1994，80(1/2):85-93.

［14］Upchurch R G.Fatty acid unsaturation，mobilization，and regulation in the response of plants to stress［J］.Biotechnology Letters，2008，30(6):967-977.

［15］Jiao Hongjun，Wang S Y.Correlation of antioxidant capacities to oxygen radical scavenging enzyme activities in blackberry［J］.J Agric Food Chem，2000，48(11):5672-5676.

［16］Ali M B，Hahn E J，Paek K Y.Effect of temperature on oxidative stress defense systems，lipid peroxidation and lipoxygenase activity in Phalaenopsis［J］.Plant Physiol Biochem，2005，43(3):213-223.