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        生理生化指標(biāo)證實8 ℃為白銀豆幼苗的臨界生長低溫*

        2013-11-25 10:02:34王長春張玉梅胡海濤
        關(guān)鍵詞:植物

        王長春,張玉梅,楊 玲,胡海濤

        (浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

        溫州白銀豆,學(xué)名利馬豆(Phaseolus lunatus L.),豆科棉豆屬,起源于熱帶美洲,屬喜溫類蔬菜,對低溫脅迫敏感[1].白銀豆主產(chǎn)于浙江省溫州瑞安市,因其籽粒營養(yǎng)豐富,富含蛋白質(zhì)、脂肪、必需氨基酸,同時含有多種礦物質(zhì)和維生素,而廣受歡迎[2],已成為當(dāng)?shù)氐囊淮笾еa(chǎn)業(yè).浙江屬于亞熱帶季風(fēng)氣候,春季天氣回暖過程中常因冷空氣的侵入使氣溫下降到8 ℃甚至5 ℃左右,這種倒春寒天氣會導(dǎo)致白銀豆遭受冷害,輕則產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響,重則受害致死,嚴(yán)重制約了白銀豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.

        確定植物的臨界生長低溫是深入研究植物抗冷性機(jī)理及改進(jìn)植物抗冷性的基礎(chǔ).筆者借助電導(dǎo)率法并基于Arrhenius 圖預(yù)估白銀豆幼苗生長的臨界低溫是8 ℃[3].本文根據(jù)葉綠素含量、光合特性、保護(hù)酶活性與膜脂過氧化的動態(tài)變化,進(jìn)一步證實8 ℃低溫脅迫作為白銀豆幼苗的臨界低溫是合理的.

        1 材料與方法

        1.1 材料培養(yǎng)及低溫處理

        溫州白銀豆(Phaseolus lunatus L)購自浙江省溫州瑞安市荊谷白銀豆合作社.飽滿白銀豆種子經(jīng)20 g/L 次氯酸鈉溶液消毒15 min,自來水流水浸泡4 h.種子分批播種至砂缽中,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),28 ℃光照14 h(06:00 -20:00),光照強度為40 μmol·m-2·s-1,待第一真葉出現(xiàn)時,用1/2 的Hoagland 營養(yǎng)液(pH 5.8)進(jìn)行水培.選取長勢基本一致的白銀豆幼苗,洗凈根部沙子,一株一孔移栽,每隔2 d 更換28 ℃下溫育的營養(yǎng)液.生長約2 周的白銀豆幼苗,第1 片三出復(fù)葉展開時進(jìn)行8 ℃低溫處理,以28 ℃生長的幼苗為對照,分別于處理1,3,6,12 和24 h 時取其第1 片三出復(fù)葉的末端小葉,測定各項指標(biāo).

        1.2 葉綠素含量測定

        采用分光光度法[4].

        1.3 熒光參數(shù)測定

        用LI-6400 和熒光葉室6400-40(美國Li-Cor公司)測定第1 片三出復(fù)葉末端小葉的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)和電子傳遞效率(ETR).

        1.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

        稱取0.5 g 葉片樣品,在預(yù)冷的4 mL pH 7.8(0.05 mol·L-1)磷酸緩沖溶液中冰浴研磨,于4 ℃下8 000 r/min 離心15 min,取上清液采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定[5].用UV-1601 型分光光度計測定560 nm 波長下的吸光度,以抑制氮藍(lán)四唑光還原的50%作為1 個酶活性單位.

        1.5 過氧化物酶(POD)活性測定

        愈創(chuàng)木酚法[5]測定POD 活性.測定系統(tǒng)含20 μL 酶提取液和3 mL 反應(yīng)液(8 μL 愈創(chuàng)木酚、19 μL 30% H2O2溶液),用0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液(pH 6.0)定容至50 mL,在470 nm 波長進(jìn)行比色,計算其單位時間內(nèi)吸光度的變化,以1 min內(nèi)A470減少1 的酶量為1 個活性單位.

        1.6 丙二醛(MDA)含量測定

        硫代巴比妥酸比色法[5]測定MDA 含量.

        其中,A450,A532和A600分別代表450,532 和600 nm波長下的吸光度.

        2 結(jié)果與分析

        2.1 8 ℃低溫脅迫對光合特性的影響

        2.1.1 低溫脅迫下葉綠素含量的動態(tài)變化

        白銀豆幼苗葉綠素含量在8 ℃低溫處理1 h后大幅上升,3 h 時達(dá)最高;6 h 時略有下降,但與3 h 時相比無顯著性差異(P <0.05);隨后,含量迅速下降,24 h 與0 h 時含量無明顯差異(見圖1).8 ℃處理1 d 的葉片總?cè)~綠素含量并不低于0 h 時,可能是因為葉片在低溫光照下大量失水,含水量降低速度高于葉綠素分解速度的緣故.

        圖1 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗葉綠素含量的變化

        2.1.2 低溫脅迫對光化學(xué)效率的影響

        光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)對環(huán)境脅迫非常敏感.葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)可以很好地反映PSⅡ的結(jié)構(gòu)和功能變化.最大光化學(xué)效率(Fv/Fm,可變熒光與最大熒光的比值)和電子傳遞速率(ETR)的大小體現(xiàn)了光系統(tǒng)光合能力的大小,是研究植物對逆境響應(yīng)的重要的生理生態(tài)參數(shù).8 ℃低溫處理下,隨時間的延長,白銀豆幼苗葉片的最大光化學(xué)效率逐漸降低,但是在12 h 時有所回升,24 h 后降低到最低值(見圖2);電子傳遞速率持續(xù)下降(見圖3).低溫脅迫使白銀豆葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率下降,潛在活性中心受損,光合作用的原初反應(yīng)受到抑制,導(dǎo)致光抑制產(chǎn)生.低溫脅迫下電子傳遞的受抑,一方面可以將過剩的光能轉(zhuǎn)化成Mehler 反應(yīng)的激發(fā)能,導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生;另一方面,以分子態(tài)氧為受體的光合電子傳遞支路反應(yīng)的增強也提高了活性氧的積累量.這些活性氧若不及時清除,必然造成氧化脅迫,引起膜脂過氧化,導(dǎo)致膜系統(tǒng)破壞.

        圖2 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗最大光化學(xué)效率的變化

        圖3 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗電子傳遞速率的變化

        2.2 8 ℃低溫脅迫對白銀豆抗氧化系統(tǒng)的影響

        2.2.1 不同脅迫時間下SOD 活性的變化

        超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)普遍存在的參與氧代謝的一種含金屬酶.由于該酶的活性大小與植物的衰老及抗逆性密切相關(guān),是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一[6].如圖4 所示,8 ℃低溫脅迫下,白銀豆葉片的SOD 活性逐漸上升,6 h 達(dá)最大值,后逐漸下降,但都高于0 h 時.SOD 活性的升高,說明白銀豆在8 ℃低溫處理過程中具有維持體內(nèi)活性氧分子產(chǎn)生與清除之間的動態(tài)平衡能力,保護(hù)植物體不受氧化脅迫.

        圖4 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗SOD 活性的變化

        圖5 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗POD 活性的變化

        2.2.2 不同脅迫時間下POD 活性的變化

        過氧化物酶(POD)能夠清除逆境條件下由于膜脂過氧化而產(chǎn)生的活性氧自由基,保護(hù)生物膜不受損傷.POD 是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一,它與SOD 和過氧化氫酶相互協(xié)調(diào)配合,清除過剩的自由基,使機(jī)體內(nèi)的自由基維持在正常的動態(tài)水平,以提高植物的抗逆性[7].8 ℃低溫脅迫下,白銀豆葉片中POD 活性先下降、后上升,在3 h 時達(dá)到最大值,隨后有所下降,處理24 h 時又上升達(dá)顯著差異(見圖5).

        2.2.3 低溫脅迫下MDA 含量的變化

        植物器官衰老或在逆境下遭受傷害時,往往發(fā)生膜脂過氧化作用[8].常以丙二醛(MDA)含量來反映植物膜脂過氧化的水平和對細(xì)胞膜的傷害程度.從圖6 可以看出,白銀豆葉片MDA 含量于8 ℃低溫處理后先上升,在3 h 時達(dá)最大值,然后逐漸下降,24 h 與0 h 時相比無明顯差異.

        2.3 8 ℃處理后白銀豆葉片冷害癥狀的恢復(fù)

        表型觀察結(jié)果(見圖7)顯示:白銀豆葉片在8 ℃低溫處理24 h 后失水萎蔫,恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)后癥狀大大緩解,基本恢復(fù)正常;在6 ℃處理24 h 后失水更為嚴(yán)重,葉片皺縮、邊緣卷縮,置正常溫度培養(yǎng)24 h 后不恢復(fù).

        圖6 8 ℃低溫處理下白銀豆幼苗MDA 含量的變化

        圖7 8 ℃,6 ℃低溫處理前后及恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)后白銀豆葉片的表型觀察

        3 討論

        細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換的主要通道,是細(xì)胞感受環(huán)境脅迫最敏感的部位[9].低溫冷害首先損傷細(xì)胞膜半透性,導(dǎo)致電解質(zhì)滲漏率增加.Arrhenius 圖折點對應(yīng)的溫度反映膜脂的相變溫度[10],指示在此溫度下膜結(jié)合酶活性的驟變及膜半透性的喪失.已有較多學(xué)者采用該法研究植物的抗冷性[10-12].筆者利用該法確定了白銀豆葉片相對電導(dǎo)率的Arrhenius 圖在8 ℃有一折點,因而視8 ℃為白銀豆幼苗生長的臨界低溫[3].

        單一指標(biāo)不能正確反映植物的抗冷性實質(zhì),只有綜合評價并采用多種方法印證,才能得出正確的結(jié)論.多數(shù)研究[12-13]表明:低溫使膜系統(tǒng)的流動性降低,細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)外滲,水分散失[14];光合作用減弱,熒光增強;活性氧的產(chǎn)生和清除平衡體系被破壞,自由基(O2-,H2O2等)的增加進(jìn)一步造成生物膜中脂質(zhì)的過氧化或脫脂化[15-16];植物體為了自我保護(hù),誘導(dǎo)SOD 等酶的活性增加,以清除活性氧自由基.

        白銀豆在8 ℃低溫脅迫初期,SOD 和POD 活性上升,分別于脅迫3 h 和6 h 達(dá)到最大值,與對照相比差異顯著.而MDA 含量在3 h 時上升到最高后逐漸下降,表明8 ℃處理3 h 時植物膜脂過氧化的水平最高,細(xì)胞膜的傷害程度最大,在光合作用方面表現(xiàn)出光合能力的下降,但是在活性氧清除系統(tǒng)的保護(hù)下,活性氧水平逐步下降,MDA含量在24 h 后下降到對照水平,植株抵御了低溫的傷害.此外,白銀豆在8 ℃處理后冷害癥狀可消失,恢復(fù)至處理前狀態(tài),說明白銀豆在該溫度下具有自我修復(fù)的能力,也印證了生理生化指標(biāo)的準(zhǔn)確性,說明8 ℃作為白銀豆的臨界低溫是合理的.

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