張 勤，應(yīng)灣灣，葛丹婷，房躍群，李 濤

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5 是關(guān)鍵的心肌發(fā)育調(diào)控因子.Nkx2.5 具有調(diào)控心肌基因表達(dá)、誘導(dǎo)發(fā)育分化、抗凋亡等重要作用.Nkx2.5 在心肌開始分化前即開始表達(dá)，是所有脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育中最早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一［1］，并參與房室結(jié)構(gòu)、流出道和傳導(dǎo)系統(tǒng)的形成.Nkx2.5 突變小鼠死于胚胎發(fā)育9～10 d，檢測發(fā)現(xiàn)其心室壁結(jié)構(gòu)薄弱、房室間隔缺損、心臟環(huán)化障礙［2］.在非洲爪蟾的胚胎中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Nkx2.5 會(huì)擴(kuò)增心肌細(xì)胞數(shù)目而導(dǎo)致心臟肥大［3］.把Nkx2.5 注射到斑馬魚胚胎中也會(huì)促使其心臟肥大性發(fā)育，甚至導(dǎo)致心肌基因的異位表達(dá)［4］.此外，研究發(fā)現(xiàn)Nkx2.5 及其相關(guān)的GATA4 轉(zhuǎn)錄因子均具有保護(hù)心肌細(xì)胞、拮抗氧化損傷的作用［5-6］.心肌特異性過表達(dá)Nkx2.5 的轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟對(duì)阿霉素引發(fā)的凋亡相對(duì)不敏感.

目前，干細(xì)胞研究中的一大熱點(diǎn)是:誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)及其他成體干細(xì)胞成為心肌細(xì)胞，并修復(fù)心肌梗死的缺陷區(qū)域及功能［7］.Nkx2.5 及GATA4 具有誘導(dǎo)心肌分化及抗凋亡的雙重作用，是基因修飾干細(xì)胞治療的理想候選分子.本研究通過構(gòu)建Nkx2.5 過表達(dá)的重組腺病毒，以期為進(jìn)一步研究Nkx2.5 的功能及潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

含Nkx2.5 cDNA 全長序列的pFLAG-Nkx2.5質(zhì)粒由Harvey R P 教授(Victor Chang Cardiac Research Institute，Sydney，Australia)惠贈(zèng).腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackcmv，骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，JM109菌、BJ5183 菌、Hela 細(xì)胞和H9c2 細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存.限制性內(nèi)切酶Pme Ⅰ(NEB)，Pac Ⅰ(NEB)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，質(zhì)粒提取試劑盒(威格拉斯).蛋白酶K 購自Merck 公司;MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega 公司;Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶均購自New England Biolabs公司;DNA marker 購自北京TIANGEN 公司;H2O2，噻唑藍(lán)(MTT)及Hoechst33342 購自Sigma公司.抗Nkx2.5 抗體購自Santa Cruz 公司.DNA序列合成由北京奧科公司完成.

1.2 Ad-Nkx2.5 腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及包裝

腺病毒包裝方法見文獻(xiàn)［8］.將pFLAGNkx2.5 和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrackcmv 用BglⅡ和SalⅠ進(jìn)行大量雙酶切.酶切DNA 片段回收，建立Nkx2.5 和pAdtrackcmv 定向連接反應(yīng)體系，構(gòu)建pAdtractcmv-Nkx2.5 質(zhì)粒.經(jīng)PmeⅠ線性化的pAdtrackcmv-Nkx2.5 質(zhì)粒熱休克轉(zhuǎn)化事先轉(zhuǎn)入腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1 的BJ5183 感受態(tài)菌，培養(yǎng)過夜后挑選克隆較小的菌落，小提質(zhì)粒后，PacⅠ酶切鑒定正確的pAd-Nkx2.5 重組腺病毒質(zhì)粒.pAd-Nkx2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109 菌大提質(zhì)粒用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染.pAd-Nkx2.5 質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，用Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后持續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)和病毒噬斑的變化.于轉(zhuǎn)后14 d 左右，待所有細(xì)胞感染病毒、變圓漂浮后，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液漂洗后液氮反復(fù)凍融細(xì)胞3 次，1 000 r/min 離心10 min 后收集上清液凍存.倍比稀釋后感染293A 細(xì)胞，24 h 后熒光顯微鏡觀察，按公式

計(jì)算病毒滴度.對(duì)照空病毒為既往保存.

1.3 重組Ad-Nkx2.5 腺病毒的PCR 鑒定

取5 μL 病毒液，加入10 μL 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)級(jí)蛋白酶K，于55 ℃作用1 h 后沸水浴5 min，取1 μL 做模板，PCR 擴(kuò)增Nkx2.5 以鑒定目的基因重組于病毒中.PCR 引物:正向引物為5′-GACAAAGCCGAGACGGAT-3′，反向引物為5′-GAAGCTCCAGAGTCTGGT-3′.產(chǎn)物長度為240 bp，退火溫度為62 ℃，PCR 循環(huán)數(shù)為30.

1.4 Nkx2.5 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測

Hela 細(xì)胞接種于6 孔板上，培養(yǎng)過夜后分別加入感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100 的病毒液.提取蛋白，二辛可酸(BCA)法蛋白定量.30 μg 蛋白煮沸后，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入抗Nkx2.5 一抗雜交，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育后化學(xué)發(fā)光法顯色.

1.5 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及病毒感染

出生1～3 d 的大鼠，無菌操作下取出心臟，剪除心房，將心室放于含1 g/L 胰蛋白酶和0.5 g/L 膠原酶Ⅰ的消化液中，剪碎后置于4 ℃連續(xù)消化，收集懸液，離心，取細(xì)胞沉淀，加入含5%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基鋪板，以差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于12 孔板中，在37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，至24 h后感染腺病毒，48 h 后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)效率和細(xì)胞形態(tài).

1.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR 檢測

參照文獻(xiàn)［8］提取RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR).PCR 引物及擴(kuò)增條件:GAPDH 基因，正向引物為5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′，反向引物為5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3，擴(kuò)增條件為58 ℃退火，共25 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小為413 bp;ANF 基因，正向引物為5′-GGCTCCTTCTCCTCACCAA-3′，反向引物為5′-CTCTGAGACGGGTTGACTTCC-3′，擴(kuò)增條件為60 ℃退火，共30 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小為269 bp;β-MHC 基因，正向引物為5′-GAGTGGACGTTTATTGACTTCGG-3′，反向引 物 為5′-GCCTTTCTTTGCTTTGCCTTT-3′，擴(kuò)增條件為61 ℃退火，共27 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物大小為405 bp.

1.7 H9c2 細(xì)胞存活率的噻唑藍(lán)法檢測

參照文獻(xiàn)［9］.活細(xì)胞代謝將噻唑藍(lán)(MTT)轉(zhuǎn)化為結(jié)晶紫，反映活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目.將感染病毒的H9c2 細(xì)胞以1 ×105/孔接種至96 孔板，以含100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL 氨芐青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的改良DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng).改良DMEM 培養(yǎng)基偏酸性，每升含15.6 g 培養(yǎng)基粉末、1.5 g NaHCO3.24 h 后加入H2O2至終濃度為200 μmol/L 誘導(dǎo)細(xì)胞，于作用后指定時(shí)間點(diǎn)加入10% 5 mg/mL MTT 溶液，37 ℃孵育4 h 后終止培養(yǎng).每孔加入150 μL 二甲基亞砜，混勻10 min 使結(jié)晶紫充分溶解.在酶標(biāo)儀490 nm 波長下測量吸光度，按公式

圖1 pAd-Nkx2.5 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

計(jì)算細(xì)胞存活率.每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次.H2O2處理組與對(duì)照組相比，用配對(duì)t 檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn).

1.8 Hoechst33342 染色及熒光觀察

H9c2 細(xì)胞加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的Hoechst33342 避光染色30 min，磷酸鹽緩沖液漂洗后繼續(xù)培養(yǎng).200 μmol/L H2O2處理6 h 后于倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯)下觀察細(xì)胞形態(tài)及核形態(tài)變化，隨機(jī)采取10 個(gè)視野拍照.

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)和單因素方差分析.P ＜0.05表示有顯著性差異，P ＜0.01 表示有非常顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 pAd-Nkx2.5 質(zhì)粒的構(gòu)建

pFLAG-Nkx2.5 質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和SalⅠ雙酶切后釋放約1.1 kb 的Nkx2.5 基因片段.將該片段連接入pAdtrackcmv 骨架質(zhì)粒中，重組成功后再經(jīng)雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1(a)所示.將經(jīng)PmeⅠ線性化的pAdtrackcmv-Nkx2.5 轉(zhuǎn)入含pAdEasy-1腺病毒骨架質(zhì)粒的BJ5183 菌，進(jìn)行同源重組，經(jīng)卡那霉素篩選，提取克隆形態(tài)較小的菌落進(jìn)一步PacⅠ酶切鑒定.正確重組的腺病毒質(zhì)粒約33 kb，可因重組位點(diǎn)不同由PacⅠ酶切切出一個(gè)3.0 或4.5 kb 的小片段，結(jié)果如圖1(b)所示.可以發(fā)現(xiàn):經(jīng)篩選的重組體clone 1 無法切出大片段，經(jīng)鑒定為未重組的pAdtrackcmv-Nkx2.5質(zhì)粒;而clone 2可以切出一大片段及一個(gè)4.5 kb 的小片段，鑒定為pAd-Nkx2.5質(zhì)粒.

2.2 Ad-Nkx2.5 腺病毒的包裝及鑒定

構(gòu)建成功的pAd-Nkx2.5 質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞進(jìn)行包裝.Ad-Easy 系統(tǒng)自帶EGFP 基因，可通過熒光顯微鏡觀察表達(dá)EGFP 的病毒噬斑快速判斷病毒包裝進(jìn)度.轉(zhuǎn)染后逐日觀察，2 d 起出現(xiàn)噬斑，7 d 后逐步增多，14 d左右可見大量表達(dá)綠色熒光蛋白的病毒噬斑(見圖2(a))，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)變圓、貼壁不牢.收獲裂解細(xì)胞，取上清液繼續(xù)感染細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，最后收獲大量的病毒懸液，經(jīng)倍比稀釋法測得重組Ad-Nkx2.5 病毒滴度為5 ×1011efu/mL.由于重組Ad-Easy 腺病毒可能存在回復(fù)突變而導(dǎo)致插入基因片段丟失，為了進(jìn)一步確認(rèn)Ad-Nkx2.5 病毒是否含有正確的插入片段，因而提取病毒上清液進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果如圖2(b)所示.pFLAGNkx2.5 質(zhì)粒及Ad-Nkx2.5 病毒上清液均能擴(kuò)增出Nkx2.5 目的片段，而對(duì)照組Ad-EGFP 病毒未攜帶Nkx2.5 基因片段，故無擴(kuò)增片段.按感染復(fù)數(shù)(MOI)為100 感染HeLa 細(xì)胞(Hela 細(xì)胞為子宮頸癌細(xì)胞，無Nkx2.5 表達(dá))，裂解細(xì)胞通過Western blot 檢測到約37 kD 的Nkx2.5 蛋白表達(dá)，而Ad-EGFP 病毒組未檢測到Nkx2.5 表達(dá)(見圖2(c)).上述實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)Nkx2.5 基因的Ad-Nkx2.5 重組腺病毒已成功包裝.

圖2 重組Nkx2.5 腺病毒的包裝及鑒定

2.3 Ad-Nkx2.5 腺病毒的乳鼠心肌細(xì)胞感染

胰酶/膠原酶消化法分離乳鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈短桿分支狀.原代乳鼠心肌細(xì)胞生長24 h后，按MOI 為100 的病毒量感染乳鼠心肌細(xì)胞.倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，80%以上的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，細(xì)胞形態(tài)清晰.Ad-Nkx2.5 感染組細(xì)胞貼壁更為牢固，形態(tài)鋪展，表面積增加，似肥大狀表型(見圖3(a)).提取RNA 進(jìn)行RT-PCR檢測Nkx2.5 下游基因ANF 及β-MHC 的表達(dá)，以GAPDH 作為內(nèi)參，結(jié)果顯示:Ad-Nkx2.5 感染后乳鼠心肌細(xì)胞的ANF 及β-MHC 表達(dá)明顯增強(qiáng)(見圖3(b)).這些結(jié)果表明Ad-Nkx2.5 腺病毒能夠表達(dá)功能性Nkx2.5 蛋白，調(diào)控乳鼠心肌細(xì)胞對(duì)Nkx2.5 下游基因的表達(dá).從而證明了功能性的Ad-Nkx2.5 腺病毒構(gòu)建成功.

2.4 Ad-Nkx2.5 腺病毒感染對(duì)H2O2介導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的拮抗

Nkx2.5是維持心肌內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子.H9c2 大鼠心肌細(xì)胞系在H2O2等外源刺激下可呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)和生化改變.H9c2 細(xì)胞感染Ad-Nkx2.5 及Ad-EGFP 腺 病 毒(MOI 為100)，200 μmol/L H2O2處理細(xì)胞后，通過MTT 法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果如圖4 所示.Ad-Nkx2.5 病毒感染后，顯著提高了H9c2 細(xì)胞的存活率.其中:

圖3 Ad-Nkx2.5 重組腺病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞

圖4 Ad-Nkx2.5 腺病毒感染后對(duì)H9c2 細(xì)胞抗氧化損傷能力的影響

H2O2誘導(dǎo)4 h 后，Ad-Nkx2.5 組細(xì)胞存活率為(87.5 ±1.9)%，Ad-EGFP 組為(43.3 ±2.5)%(P ＜0.01，n=4);H2O2誘導(dǎo)8 h 后，Ad-Nkx2.5組細(xì)胞存活率為(82.5 ±2.3)%，Ad-EGFP 組為(27.8 ±3.7)%(P ＜0.01，n=4);H2O2誘導(dǎo)12 h后，Ad-Nkx2.5 組細(xì)胞存活率為(75.4 ±1.8)%，Ad-EGFP 組為(22.1 ±1.9)%(P ＜0.01，n=4).

Ad-Easy 腺病毒感染細(xì)胞后表達(dá)綠色熒光蛋白，顯示細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu);同時(shí)，采用親核染料Hoechest33342 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色，即可對(duì)H9c2細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變進(jìn)行觀測，結(jié)果如圖5 所示.H9c2 細(xì)胞感染Ad-EGFP 病毒，200 μmol/L H2O2處理6 h 后，即出現(xiàn)典型的凋亡表現(xiàn):細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間連接消失，部分細(xì)胞發(fā)生脫落飄浮，胞膜有小泡狀形成，細(xì)胞核固縮，密度增加，部分核碎裂，部分細(xì)胞綠色熒光消失，細(xì)胞崩解.而Ad-Nkx2.5感染組發(fā)生細(xì)胞皺縮和核固縮的細(xì)胞數(shù)目明顯少于Ad-EGFP 組，說明重組腺病毒介導(dǎo)的Nkx2.5過表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡.

圖5 Ad-Nkx2.5 腺病毒感染抑制H9c2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化(×200)

3 討論

心肌細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞，一旦壞死或凋亡基本無再生能力，只能進(jìn)行瘢痕修復(fù)，造成心肌收縮和傳導(dǎo)功能不可逆性的損失.近年來，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其他成體干細(xì)胞修復(fù)病損心肌組織成為研究的熱點(diǎn).盡管成體干細(xì)胞存在取材方便、無移植排斥、無倫理問題等優(yōu)勢，但其橫向分化為心肌樣細(xì)胞受誘導(dǎo)分化微環(huán)境的調(diào)控，分化效率有限.如何提高誘導(dǎo)分化效率從而更好地改善心功能，仍然是一個(gè)有待深入研究的科學(xué)問題.目前，人們通過藥物誘導(dǎo)、微環(huán)境模擬、電場刺激、轉(zhuǎn)基因等方式，對(duì)成體干細(xì)胞進(jìn)行心肌誘導(dǎo)分化的嘗試［7］.通過轉(zhuǎn)基因定向誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌分化，Nkx2.5 是一個(gè)重要的候選基因.

Nkx2.5 是果蠅tinman 的同源基因，均為控制體節(jié)發(fā)育的同源異型盒基因家族成員.果蠅的tinman 基因是第一個(gè)被證實(shí)在果蠅心臟形成和分化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，tinman 基因突變可以使果蠅心臟缺失或異常.Nkx2.5 則是調(diào)控哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育和功能執(zhí)行的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子.原位標(biāo)記技術(shù)顯示，在小鼠胚胎發(fā)育7.5 d 時(shí)Nkx2.5即開始在生心板表達(dá)［1］.

Nkx2.5 通過調(diào)控心肌基因表達(dá)從而廣泛地參與了心臟發(fā)育及其功能維持，如心肌分化、房室結(jié)構(gòu)組建、流出道形成、傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育和功能維持.目前已知Nkx2.5 的下游基因涉及到心肌泵功能相關(guān)蛋白、分泌性蛋白、縫隙鏈接和電傳導(dǎo)相關(guān)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白、鈣調(diào)控相關(guān)蛋白和心肌轉(zhuǎn)錄因子［10-12］等.因此，Nkx2.5 純合子突變會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育中斷而死亡;其雜合子突變會(huì)導(dǎo)致各種先天性心臟病，最常見的是房間隔缺損和房室傳導(dǎo)阻滯［10］.Jay 等［13］發(fā)現(xiàn)，在Nkx2.5 缺失時(shí)，心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的細(xì)胞減少、傳導(dǎo)和電生理異常，其機(jī)理可能與Nkx2.5 調(diào)控傳導(dǎo)細(xì)胞縫隙連接Connexin40 相關(guān).Pashmforoush 等［14］在小鼠出生后于心室組織特異性地敲除Nkx2.5 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)心小梁形成、腔室擴(kuò)大進(jìn)而表現(xiàn)為漸進(jìn)性心衰;同時(shí)，特定肌細(xì)胞來源的房室結(jié)細(xì)胞逐漸被疤痕組織所取代，導(dǎo)致心臟電傳導(dǎo)缺失.從而證實(shí)出生后心臟泵系統(tǒng)和傳導(dǎo)系統(tǒng)的功能維持同樣依賴于Nkx2.5 的正常表達(dá).此外，Nkx2.5 是首個(gè)被溯源發(fā)現(xiàn)的法樂氏四聯(lián)癥致病基因，目前已經(jīng)建立了Nkx2.5 基因突變與多個(gè)人類先天性心臟病的病理關(guān)聯(lián)［15］.Nkx2.5 突變的患者常表現(xiàn)為各種心臟發(fā)育異常和傳導(dǎo)阻滯.

基于Nkx2.5 的功能多樣性和重要性，目前已在多種細(xì)胞中驗(yàn)證了其誘導(dǎo)干細(xì)胞心肌特異分化的能力.例如:在P19 畸胎瘤干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Nkx2.5 可以讓細(xì)胞擺脫對(duì)外源誘導(dǎo)劑的依賴，僅需形成擬胚體即可分化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞［16］;Nkx2.5 過表達(dá)的胚胎干細(xì)胞向心室肌優(yōu)勢分化，同時(shí)削弱了向血管系統(tǒng)分化的能力［17］.研究亦表明，Nkx2.5 單一過表達(dá)或GATA4 協(xié)同過表達(dá)的骨髓干細(xì)胞均能增強(qiáng)心肌誘導(dǎo)分化能力，從而改善心肌梗死區(qū)域的功能［18-19］.此外，篩選Nkx2.5 表達(dá)陽性的心肌前體細(xì)胞或心肌干細(xì)胞加以擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化，也在研究之中［20-21］.另外，Nkx2.5 能夠保護(hù)心肌細(xì)胞，拮抗外源刺激造成的損傷和凋亡，但具體機(jī)制尚不明了［5-6］.因此，Nkx2.5 陽性細(xì)胞不但可以增強(qiáng)心肌特異分化能力，還有助于細(xì)胞在缺血、缺氧、炎癥細(xì)胞侵潤、壓力超負(fù)荷、氧化應(yīng)激、感染等凋亡誘導(dǎo)條件下的存活.

本研究成功包裝重組了Nkx2.5 過表達(dá)腺病毒，感染原代乳鼠心肌細(xì)胞及傳代H9c2 細(xì)胞，并驗(yàn)證了其調(diào)控心肌基因表達(dá)及拮抗氧化損傷的能力，為進(jìn)一步研究Nkx2.5 的功能及潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值奠定了基礎(chǔ).重組Nkx2.5 病毒可應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，如干細(xì)胞心肌誘導(dǎo)分化、心梗后的心肌凋亡與修復(fù)、心肌內(nèi)穩(wěn)態(tài)維護(hù)、心肌傳導(dǎo)阻滯的轉(zhuǎn)基因治療等.

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