陳林，吳克剛，柴向華，余林，劉曉麗，陳琰華

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院食品系，廣東廣州，510006)

蛋白質(zhì)酶解是利用蛋白水解酶在溫和條件下催化蛋白質(zhì)水解成氨基酸和小肽。酶解反應(yīng)速度快，條件溫和，專一性強(qiáng)，無氨基酸破壞和有害物質(zhì)產(chǎn)生，無環(huán)境污染，故被認(rèn)為是水解食品蛋白的最佳方法。蛋白質(zhì)經(jīng)適度酶解后除了保留甚至提高其生物價(jià)外，功能特性明顯優(yōu)于原始蛋白質(zhì);利用蛋白質(zhì)酶解制備生物活性肽更是成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。然而由于許多食品蛋白特殊的組成和結(jié)構(gòu)，蛋白分子高度壓縮、結(jié)構(gòu)緊密，對(duì)蛋白酶的水解作用具有很強(qiáng)的抵抗力。近年來，許多研究都發(fā)現(xiàn)在酶解前采用適當(dāng)?shù)奈锢眍A(yù)處理，使蛋白變性或改變其組成及結(jié)構(gòu)，可顯著地改善許多食品蛋白的酶解敏感性，從而提高水解度(DH)、縮短酶水解時(shí)間、提高酶的利用率、并使有效產(chǎn)物的得率大大提高。此外，物理預(yù)處理技術(shù)具有操作簡單、無毒副作用、對(duì)營養(yǎng)破壞小等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于在食品工業(yè)中應(yīng)用。因此，物理預(yù)處理對(duì)食品蛋白酶解特性的影響已越來越受到食品科學(xué)領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。本文擬對(duì)國內(nèi)外用于促進(jìn)食品蛋白酶解的物理預(yù)處理技術(shù)的作用機(jī)理、影響因素、應(yīng)用優(yōu)缺點(diǎn)等方面的研究進(jìn)展做一綜述。

1 蛋白酶解的物理預(yù)處理技術(shù)

物理預(yù)處理是利用熱、微波、聲能、高壓、機(jī)械能等物理作用形式，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行處理從而改變其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，使更多的酶解位點(diǎn)得以暴露而與蛋白酶作用，從而促進(jìn)蛋白酶解。事實(shí)上，物理預(yù)處理與物理改性的原理相同，只是物理預(yù)處理的目的是改善蛋白酶解敏感性，而物理改性的目的是改善蛋白功能特性。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前常用的物理預(yù)處理主要有加熱、超聲波、擠壓、超高壓和高速剪切。

1.1 加熱預(yù)處理

酶水解蛋白前進(jìn)行加熱處理是一種常用的預(yù)處理方法。加熱處理可以破壞氫鍵、疏水相互作用和范德華力等次級(jí)鍵，通過變性使蛋白質(zhì)成為松散的結(jié)構(gòu)，原來包埋于內(nèi)部的酶水解位點(diǎn)被暴露。但是由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相互差異很大，因此加熱變性的效果也隨蛋白質(zhì)的不同而變化。有研究表明許多植物蛋白(如大豆蛋白［1－2］，花生蛋白［3］，大麻蛋白［4］，油菜籽蛋白［5］)在熱變性后比原始蛋白更容易被酶水解，因?yàn)橹参锏鞍捉?jīng)過適度熱處理后，維系其蛋白空間結(jié)構(gòu)的氫鍵、疏水相互作用、范德華力等次級(jí)鍵遭到破壞，引起酶解位點(diǎn)暴露，有利于酶的攻擊，使植物蛋白的水解更容易進(jìn)行。如陶紅等［1］發(fā)現(xiàn)大豆蛋白經(jīng)過90℃水浴加熱10 min，其水解度由未經(jīng)熱處理的12.0%提高到20.3%，這說明適當(dāng)?shù)募訜犷A(yù)處理可以顯著提高植物蛋白的酶解敏感性。

但是動(dòng)物蛋白在熱變性后酶解敏感性往往會(huì)下降。如Mohr［6］報(bào)道了魚肉蛋白熱變性后不利于被酶作用轉(zhuǎn)化成可溶性氮;段振華等［7］研究發(fā)現(xiàn)鳙魚下腳料在酶解前熱處理其水解度明顯低于不經(jīng)熱處理的樣品。這可能是因?yàn)閯?dòng)物蛋白(肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白)富含巰基(—SH)，而植物蛋白(如小麥面筋蛋白、玉米蛋白)中硫主要以二硫鍵(—S—S—)形式存在，所以動(dòng)物蛋白經(jīng)熱處理后，往往導(dǎo)致—SH破壞(半胱氨酸、胱氨酸間氧化縮合)，形成更穩(wěn)定的—S—S—鍵，不利于水解酶的作用，引起蛋白酶解敏感性的降低［8］。此外，無論對(duì)哪種蛋白，必須掌握好適當(dāng)?shù)臒崽幚沓潭龋瑴囟冗^高或加熱時(shí)間過長，都會(huì)使已變性展開的蛋白分子因疏水相互作用或形成－SS－導(dǎo)致致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，酶解位點(diǎn)反而被包埋［3－4］。

加熱預(yù)處理的方式主要有水浴法、水熱法和微波加熱。水浴法以水為介質(zhì)，在常壓條件下對(duì)蛋白進(jìn)行加熱處理。水熱法是在密閉的壓力容器中(如高壓滅菌鍋)，以水或其他液體作為介質(zhì)，在高壓條件下對(duì)蛋白進(jìn)行加熱處理。在水熱法中，由于蛋白質(zhì)同時(shí)經(jīng)歷高溫、高壓2種作用，因此會(huì)發(fā)生一些常壓加熱不會(huì)出現(xiàn)的變化。如Radha等［2］在酶解前對(duì)商品化大豆分離蛋白分別進(jìn)行水浴法加熱(90℃)和水熱法加熱(121℃，9.8 MPa)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水浴法加熱預(yù)處理對(duì)商品化大豆分離蛋白的酶解敏感性沒有顯著影響;但是水熱法加熱預(yù)處理卻有明顯的改善效果。原因可能是高溫和高壓相聯(lián)合對(duì)破壞大豆蛋白中的二硫鍵具有協(xié)同增效作用，因此可使已發(fā)生變性聚集的蛋白分子展開［9］。

微波加熱利用頻率108～1011Hz的電磁波產(chǎn)生交變電磁場(chǎng)，使物料中極性分子產(chǎn)生高速取向運(yùn)動(dòng)，相互摩擦，溫度急劇升高，從而達(dá)到加熱的目的。目前已有研究報(bào)道了微波加熱預(yù)處理可以改善大豆蛋白［10－11］、蛾豆蛋白［12］的酶解敏感性。影響微波加熱預(yù)處理效果的重要因素是微波功率和加熱時(shí)間。齊蓮子等［10］在酶解前采用微波加熱對(duì)脫脂豆粕進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳預(yù)處理?xiàng)l件是:微波功率420 W，處理時(shí)間2 min，該條件下水解度提高了2.0%;如繼續(xù)增大微波功率或延長加熱時(shí)間，水解度反而會(huì)下降。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，微波加熱預(yù)處理對(duì)蛋白質(zhì)酶解的促進(jìn)效果與水浴加熱接近，但微波加熱所需的時(shí)間更短［11］。這是因?yàn)槲⒉ㄊ且环N電磁波，對(duì)物料具有穿透性，可使物料內(nèi)部和外部同時(shí)受熱。因此微波加熱與常規(guī)加熱方式相比，具有加熱迅速的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)固體和半固體等存在加熱溫度梯度的食品尤為有效。

1.2 超聲波預(yù)處理

超聲波可分為2類:一類是高頻率低振幅超聲波(頻率范圍5～10 MHz)，這種超聲波的能量比較小，一般小于1 W/cm2，可用于食品的無損檢測(cè)，因此也被稱為檢測(cè)超聲波。另一類是低頻率高振幅超聲波(頻率范圍20～100 kHz)，這種超聲波的能量很大，可達(dá)10～1000 W/cm2，因此被稱為功率超聲波。功率超聲波在介質(zhì)傳播時(shí)具有空化效應(yīng)，可產(chǎn)生高速微射流、強(qiáng)烈沖擊波和局部高溫，具有改變物質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的能力。功率超聲波是一種用途廣泛的新興食品加工技術(shù)，已在食品工業(yè)中被用于殺菌、乳化、提取、干燥、加速氧化等。功率超聲波有2種處理方式——探頭式超聲技術(shù)和槽式超聲技術(shù)。探頭式超聲對(duì)液態(tài)樣品進(jìn)行處理時(shí)，超聲探頭直接浸入液體，其聲強(qiáng)可達(dá)數(shù)百W/cm2。槽式超聲對(duì)液態(tài)樣品進(jìn)行處理時(shí)，反應(yīng)液可直接裝入槽內(nèi)，但聲波經(jīng)過反射、衰減等損耗，真正作用于反應(yīng)液的聲強(qiáng)較小。在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，對(duì)食品蛋白(如大豆蛋白［11，13－14］、花生蛋白［15］、小麥面筋蛋白［16］、酪蛋白［17］)的酶解預(yù)處理多采用探頭式超聲技術(shù)，因?yàn)樘筋^式超聲比槽式超聲的功率密度大［18］。

超聲波的功率是影響蛋白酶解敏感性的重要因素。本課題組采用28 kHz超聲波對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在超聲波功率為400 W時(shí)，水解度最大(提高了3.1%);之后隨著功率的增大，水解度逐漸下降［13］。這說明預(yù)處理時(shí)超聲波功率也不是越大越好，功率過大可能導(dǎo)致蛋白變性聚集，反而不利于蛋白酶解。除了功率外，超聲波的作用效果還受處理時(shí)間、樣品溫度、pH 等的影響［14－17］。有研究表明，超聲波可以破壞蛋白分子內(nèi)或分子間的疏水作用和范德華力，但對(duì)氫鍵和二硫鍵影響卻很小，因此超聲波對(duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響與熱效應(yīng)不同［18］。云田田等［11］比較了加熱(水浴、微波)和超聲波對(duì)大豆粕蛋白酶解敏感性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理的效果不如加熱預(yù)處理。原因可能是超聲波對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)有破壞作用，但對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較小，因此只能使蛋白部分展開。

1.3 擠壓預(yù)處理

擠壓技術(shù)是現(xiàn)代食品加工的高新技術(shù)之一，擠壓機(jī)集加熱、加壓、剪切、膨化等多種單元于一體，且擠壓過程在極短時(shí)間內(nèi)就可完成。在擠壓機(jī)筒內(nèi)，蛋白原料在高溫(100～200℃)、高壓(2～10 MPa)作用下，發(fā)生包括共價(jià)鍵、二硫鍵、肽鍵和次級(jí)鍵在內(nèi)的復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)，使蛋白失去原有結(jié)構(gòu)，物料形成連續(xù)的塑性‘熔融體’;在螺桿剪切作用下，‘熔融體’中蛋白分子呈現(xiàn)線性定向排列(纖維狀);最后由模頭擠出時(shí)，物料從高壓高熱狀態(tài)突然進(jìn)入大氣常壓環(huán)境中，擠出物因此釋放出大量過熱蒸汽，發(fā)生膨化作用。從物理特性來說，擠壓使蛋白原料轉(zhuǎn)變成膨松和多孔狀的結(jié)構(gòu);從化學(xué)觀點(diǎn)來說，擠壓使原料中的蛋白重新組合成有一定結(jié)構(gòu)的纖維狀蛋白體系［19］。

目前國內(nèi)外已有不少研究報(bào)道了擠壓預(yù)處理對(duì)大豆蛋白［19－21］、玉米蛋白［22］、小麥面筋蛋白［23］、蕓豆蛋白［24］的酶解敏感性的影響。如 Marsman等［19］發(fā)現(xiàn)在雙螺桿擠壓過程中大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變性重組，由球狀聚集態(tài)重組為伸展纖維狀，更多的酶切位點(diǎn)因此暴露出來，蛋白的酶解敏感性得以提高。本課題組之前的研究比較了超聲、超高壓、擠壓3種預(yù)處理對(duì)商品化大豆分離蛋白酶解敏感性的改善效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擠壓預(yù)處理的效果最好［19－20］。這可能是因?yàn)閿D壓預(yù)處理對(duì)蛋白的改性作用比較強(qiáng)，不僅可以破壞次級(jí)鍵，而且可以破壞二硫鍵、肽鍵等共價(jià)鍵，并使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生重組，形成易于酶解的結(jié)構(gòu)。因此對(duì)于已經(jīng)發(fā)生變性聚集的商品化大豆分離蛋白，擠壓預(yù)處理也能顯著改善其酶解敏感性。

擠壓預(yù)處理效果與擠壓過程的溫度、物料含水量和螺桿轉(zhuǎn)速密切相關(guān)。如柴華等［23］研究發(fā)現(xiàn)擠壓預(yù)處理中各因素對(duì)小麥面筋蛋白酶解敏感性的影響主次關(guān)系為:螺桿轉(zhuǎn)速＞物料含水量＞溫度;最優(yōu)擠壓預(yù)處理工藝條件是:螺桿轉(zhuǎn)速130 r/min、物料含水量50%、溫度145～150℃，小麥面筋蛋白的水解度由未經(jīng)擠壓處理的6.93%提高到15.49%。本課題組發(fā)現(xiàn)擠壓預(yù)處理溫度對(duì)大豆分離蛋白的酶解敏感性有顯著影響;最優(yōu)處理溫度是160℃，大豆分離蛋白的水解度由未經(jīng)擠壓預(yù)處理的 4.5%提高到11.3%［20］?？梢?，適當(dāng)?shù)臄D壓預(yù)處理對(duì)食品蛋白是一種非常有效的酶解預(yù)處理技術(shù)。

1.4 超高壓預(yù)處理

超高壓(＞100 MPa)可使維系生物高分子立體結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵破壞，并誘導(dǎo)分子構(gòu)象進(jìn)行重排，從而對(duì)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生影響。根據(jù)處理方式的不同，可分為靜高壓和動(dòng)態(tài)高壓(高壓均質(zhì))。

據(jù)報(bào)道，靜高壓處理對(duì)許多食品蛋白(如大豆蛋白［25］、β－乳球蛋白［26－27］、卵清蛋白［28］、雞蛋清蛋白［29］)的酶解敏感性都有改善作用，且作用效果與處理壓力密切相關(guān)。如Chicón等［28］發(fā)現(xiàn)當(dāng)靜高壓預(yù)處理的壓力達(dá)到200 MPa，β－乳球蛋白的水解度才有顯著提高;而Jung等［25］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)靜高壓預(yù)處理的壓力達(dá)到500 MPa，大豆粕蛋白的水解度才有顯著提高。有研究表明，靜高壓可以破壞蛋白分子內(nèi)或分子間的疏水相互作用、范德華力等次級(jí)鍵，但二硫鍵對(duì)靜高壓不敏感［27，30］。如 Kieffer等［30］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)靜高壓達(dá)到1 000 MPa時(shí)，小麥面筋蛋白的二硫鍵才開始被破壞。因此對(duì)含有較多二硫鍵的食品蛋白(如小麥面筋蛋白、玉米蛋白、鷹嘴豆蛋白等)，靜高壓預(yù)處理的效果可能不顯著。如Zhang等［31］發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆分離蛋白經(jīng)過靜高壓預(yù)處理(200～600 MPa)后，其水解度沒有顯著變化。

靜高壓處理時(shí)樣品僅僅產(chǎn)生高壓誘導(dǎo)的變化，而在高壓均質(zhì)過程中，劇烈的處理?xiàng)l件如高壓、強(qiáng)烈剪切、空穴爆炸、高頻振蕩等機(jī)械力的綜合作用將導(dǎo)致物料分子結(jié)構(gòu)發(fā)生更顯著的變化。此外，高壓均質(zhì)可連續(xù)操作，是工業(yè)化生產(chǎn)的有利條件，因此被認(rèn)為是食品加工中最有潛力和發(fā)展前途的物理改性技術(shù)之一。目前已有研究報(bào)道了高壓均質(zhì)對(duì)食品蛋白酶解敏感性的影響。如Dong等［32］發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)預(yù)處理在40 MPa壓力下就可顯著提高花生蛋白的酶解敏感性。陳劍兵等［33］也發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)預(yù)處理對(duì)油菜籽蛋白的酶解有促進(jìn)作用，且隨著壓力的增大(0～120 MPa)作用效果越明顯。

1.5 高速剪切預(yù)處理

目前有學(xué)者研究了高速剪切預(yù)處理對(duì)大豆蛋白［10，34］、玉米蛋白［35］的酶解敏感性的影響。如郭維靜［35］等發(fā)現(xiàn)玉米蛋白粉分散液經(jīng)高速分散均質(zhì)機(jī)剪切預(yù)處理后，底物顆粒粒徑顯著減小，水解度顯著增大。據(jù)報(bào)道，高速剪切作用可破壞蛋白聚集體和蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使原本被包埋的酶解位點(diǎn)暴露出來，有利于酶的攻擊，從而促進(jìn)蛋白的酶水解［10］。

影響高速剪切預(yù)處理效果的重要因素是樣品黏度、剪切速率和剪切時(shí)間。高速剪切預(yù)處理通常不適用于黏度較大的蛋白樣品，因?yàn)闃悠佛ざ仍酱?，剪切?xì)化的效果越差［35］。在一定范圍內(nèi)，剪切速率越大、剪切時(shí)間越長，底物顆粒的粒徑越小，越有利于提高蛋白的酶解敏感性;但是如果剪切速率過高或剪切時(shí)間過長，都會(huì)使樣品溫度升高，導(dǎo)致蛋白過度變性，形成不溶性蛋白聚集體，反而不利于酶水解［10］。齊蓮子等［34］采用高速組織搗碎機(jī)對(duì)大豆分離蛋白分散液進(jìn)行高速剪切預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)處理?xiàng)l件下(蛋白濃度100 g/L、剪切速率6 000 r/min、剪切時(shí)間4 min)，其水解度提高了2.87%。

2 幾種蛋白酶解物理預(yù)處理技術(shù)的比較

不同物理預(yù)處理技術(shù)的作用機(jī)理和設(shè)備不盡相同，因此對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響也不同，所適用的蛋白原料也不同。如何選擇合適的物理預(yù)處理技術(shù)和處理工藝條件，對(duì)于改善食品蛋白的酶解敏感性是十分重要的。從表1可以看出，目前報(bào)道的蛋白酶解預(yù)處理技術(shù)各有利弊，在本文之前的部分也做了較為詳細(xì)的分析探討。目前從實(shí)際對(duì)食品蛋白酶解敏感性的改善效果來看，水熱法和螺桿擠壓的效果最好。它們對(duì)許多食品蛋白的酶解敏感性有明顯的改善效果，甚至可以提高已變性聚集蛋白的酶解敏感性。由于商品化蛋白原料大都經(jīng)過噴霧干燥、高溫殺菌等高溫?zé)崽幚恚鞍滓寻l(fā)生變性聚集。因此水熱法和擠壓預(yù)處理可用于改善商品化蛋白原料的酶解敏感性，在蛋白酶解工業(yè)化生產(chǎn)中有良好的應(yīng)用前景。但是這2種方法也都還有缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步改進(jìn)。比如水熱法預(yù)處理對(duì)設(shè)備要求高，操作較復(fù)雜;而擠壓預(yù)處理使食品品質(zhì)和風(fēng)味發(fā)生變化。值得注意的是，這2種技術(shù)都集成了幾種物理作用相互配合(其中水熱法處理中物料同時(shí)經(jīng)歷高溫、高壓2種作用;擠壓處理中物料同時(shí)經(jīng)歷高溫、高壓、剪切、膨化)，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的破壞效果，而且還可誘導(dǎo)蛋白重組，形成易于酶解的結(jié)構(gòu)形態(tài)。因此合理地將協(xié)同增效顯著、工序銜接性好、安全便捷的幾種物理作用相聯(lián)合，可以形成可行有效的復(fù)合預(yù)處理技術(shù)。

表1 幾種蛋白酶解物理預(yù)處理技術(shù)的比較Table 1 The comparison of several physical pre-treatment techniques used for protein enzymatic hydrolysis

目前已有學(xué)者研究了幾種物理預(yù)處理作用相聯(lián)合對(duì)食品蛋白酶解敏感性的影響。如Riener等［36］在酶解前采用‘熱超聲’對(duì)牛奶蛋白進(jìn)行預(yù)處理(先將牛奶蛋白粉分散液水浴加熱到一定溫度，然后在此溫度下進(jìn)行超聲波處理)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在溫度72℃、超聲波功率400 W，處理10 min，牛奶蛋白的水解度提高了3.2%;如果不加熱，水解度只提高了2.1%。樂堅(jiān)等［37］將高速剪切(3 min)、高壓均質(zhì)(20 MPa)、熱處理(90℃，10 min)聯(lián)合起來對(duì)商品化大豆分離蛋白進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水解度提高了5.4%。幾種物理預(yù)處理相聯(lián)合，對(duì)食品蛋白酶解敏感性的改善可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同增效作用，但同時(shí)也增加了成本，加大了操作難度。

3 展望

物理預(yù)處理可以改變蛋白分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間的聚集狀態(tài)，使其緊密的結(jié)構(gòu)松散開，暴露出更多的酶解位點(diǎn)，或形成某種易于酶解的形態(tài)，從而提高了蛋白的酶解敏感性，因此物理預(yù)處理是實(shí)現(xiàn)食品蛋白質(zhì)高效酶解的有效手段。此外，物理預(yù)處理無毒副作用，非常適合于在食品工業(yè)中應(yīng)用。目前國內(nèi)外已有不少物理預(yù)處理改善食品蛋白酶解敏感性的報(bào)道。許多物理預(yù)處理對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)有明顯的影響，但是處理過程中蛋白結(jié)構(gòu)變化以及處理后蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)其酶解特性的影響國內(nèi)外研究很少，蛋白結(jié)構(gòu)與其酶解敏感性的相關(guān)性研究還不深入，預(yù)處理對(duì)酶解產(chǎn)物功能特性的影響研究也較少。為了更好地對(duì)物理預(yù)處理和蛋白酶解加以控制，今后有必要進(jìn)一步探索物理預(yù)處理后蛋白結(jié)構(gòu)變化與酶解敏感性的內(nèi)在關(guān)系。

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