王 瑾，王曉樑，白克華，燕 子，王 麗，劉慧榮，(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，太原 0000;山西醫(yī)科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室;首都醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)系;通訊作者，E-mail:liuhr000@6.com)

衰老是生物體在生命過程中，機體各組織器官隨年齡增長發(fā)生的一系列慢性、進(jìn)行性、退化性改變。心臟是生命的重要器官，伴隨增齡衰老，形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。大量研究表明，從17歲到90歲，單純由于年齡因素，人體心肌細(xì)胞減少約1/3［1－4］。心肌細(xì)胞丟失后可能導(dǎo)致心臟功能下降進(jìn)而促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生［5，6］。目前研究已知，組織器官中導(dǎo)致功能細(xì)胞丟失的主要原因有細(xì)胞死亡和腫瘤發(fā)生［7］，而細(xì)胞死亡又包括了壞死(necrosis)、自體吞噬(autophagy)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)和非凋亡性程序性細(xì)胞死亡(paraptosis)等方式［1，8，9］。Nitahara 等研究表明，在衰老小鼠心臟中，細(xì)胞壞死和凋亡均有出現(xiàn)，但隨著年齡增加，左心室心肌細(xì)胞的凋亡率逐漸上升，而壞死的發(fā)生率并沒有改變［10］，提示在衰老過程中凋亡可能是促進(jìn)心肌細(xì)胞丟失的主要方式之一。那么，衰老過程發(fā)生的心肌細(xì)胞凋亡對老年大鼠心功能有何影響?

1 材料和方法

1.1 動物及分組

健康、成年雄性SD大鼠，體重280－300 g，3月齡;健康、老年雄性SD大鼠，體重500－550 g，15月齡。購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。實驗動物的使用遵循中華人民共和國衛(wèi)生部令(第55號)—醫(yī)學(xué)實驗動物管理實施細(xì)則，以及山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理細(xì)則，并得到了山西醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)協(xié)會的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

TUNEL檢測試劑盒(Boehringer Mannheim，USA)，caspase-3凋亡檢測試劑盒(Biological Industries，Israel)，Hochest33258，Sigma;cy3 標(biāo)記的羊抗大鼠二抗，Sigma;抗肌原纖維α-actin抗體，武漢博士德;廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK，Sigma;其余試劑均為國產(chǎn)GR級，所用溶液均以超純水配制。S/NE10023酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司;MS2000生物信號記錄分析系統(tǒng)，成都泰盟公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 分別從成年大鼠以及老年大鼠中隨機選取大鼠進(jìn)行分組:成年組(n=10)、老年組(n=10)以及廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK組(n=10，老年大鼠+Z-VAD-FMK)。Z-VAD-FMK組大鼠實驗前經(jīng)腹腔注射Z-VAD-FMK 6 mg/kg，其余各組分別腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3.2 大鼠在體心功能測定 各組大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(1 g/kg)麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上;于頸前皮膚處沿正中線作一約2.5 cm的切口，分離頸前肌群至氣管，分離右側(cè)頸總動脈并結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端用小動脈夾夾閉;用眼科剪剪一“V”字形切口，將充滿肝素生理鹽水的導(dǎo)管插入切口，打開動脈夾，導(dǎo)管經(jīng)右頸總動脈插入左心室并結(jié)扎固定。導(dǎo)管的另一端借三通管連接P-50壓力換能器，壓力信號輸入MS2000生物信號記錄分析系統(tǒng)。導(dǎo)管插入左心室后穩(wěn)定15－20 min記錄心功能各參數(shù)，包括左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張壓(left ventricular diastolic pressure，LVDP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)以及左心室內(nèi)壓上升和下降的最大速率(±dP/dtmax)。在本研究中，我們采用心室收縮指數(shù)(CI)反映心臟的收縮功能。CI=+dP/dtmax/LVSP，其結(jié)果不受舒張末壓和大動脈血壓的影響，較+dP/dtmax能更好地反映心臟收縮功能。用LVDP、LVEDP反映心臟的舒張功能。

1.3.3 心質(zhì)量/體質(zhì)量的測定 各組大鼠處死后開胸，迅速取出心臟，洗凈心腔內(nèi)積血，去除心臟周圍組織及血管，用濾紙吸干水分后稱量全心重，計算心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值。

1.3.4 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測

1.3.4.1 TUNEL 染色 利用 In Situ Cell Death Detection試劑盒進(jìn)行檢測各組大鼠的凋亡?；救旧襟E如下:將組織切片常規(guī)脫蠟;梯度酒精中水化;蛋白酶K消化;配制含末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Ⅰ液)和熒光素標(biāo)記的dUTP(Ⅱ液)混合反應(yīng)液，加入后孵育;再滴加連接堿性磷酸酶的抗熒光素抗體孵育;堅固紅呈色;蘇木素輕襯染，甘油封片。應(yīng)用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。每張切片隨機選取10個高倍視野(×400)，計數(shù)凋亡陽性細(xì)胞(熒光顯微鏡下為綠色;光鏡下為棕色)，以凋亡指數(shù)反映心肌細(xì)胞凋亡的情況。凋亡指數(shù)=(視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個數(shù)/視野內(nèi)所有心肌細(xì)胞個數(shù))×100%。

1.3.4.2 caspase-3活性測定 各組大鼠心肌組織caspase-3活性用caspase-3檢測試劑盒測定。取心肌組織，按1 mg組織加入10 μl裂解液的比例進(jìn)行稀釋，置冰上剪碎，勻漿，離心。上清以考馬斯亮蘭試劑盒測定蛋白濃度。取上清、反應(yīng)緩沖液，底物(DEVD-pNA)加至ELISA板中水浴后，用酶標(biāo)儀測定光密度值。結(jié)果以實驗孔的光密度值減去背景對照光密度值來表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman’s相關(guān)分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 老年大鼠心臟的心質(zhì)量/體質(zhì)量比下降，收縮和舒張功能均下降

與成年大鼠相比，老年大鼠的心臟質(zhì)量顯著增加［(0.61 ±0.04)gvs(1.42 ±0.04)g，P＜0.01］，但與成年大鼠相比，老年大鼠的心質(zhì)量/體質(zhì)量卻顯著下降(0.31% ±0.01%vs0.26% ± 0.01%，P＜0.01)，提示老年大鼠的心臟相對質(zhì)量明顯降低。

血流動力學(xué)結(jié)果表明，與成年大鼠相比，老年大鼠心肌收縮功能的相應(yīng)指標(biāo)明顯下降(46.82±3.176 s－1vs37.23 ±1.52 s－1，P＜0.05，見圖 1A);而反映心肌舒張功能的LVDP［(0.16±0.17)kPavs(－1.16 ±0.35)kPa］與 LVDEP［(1.25 ±0.35)kPavs(－0.70 ±0.43)kPa］均明顯升高(P＜0.01，見圖1B，1C)。

2.2 老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加

圖1 成年大鼠和老年大鼠心臟功能的比較 (n=10)Figure 1 Comparison of cardiac functions between aged rats and adult rats (n=10)

TUNEL結(jié)果(圖2)顯示，成年大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為0.86% ±0.29%，老年大鼠達(dá)到2.86% ±0.43%，二者相比，老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0.05，見圖3A);與成年大鼠心肌組織的caspase-3比活性(1.00±0.028)相比，老年大鼠caspase-3的比活性(2.21±0.327)顯著增高(P＜0.01，見圖3B)。

圖2 老年大鼠心肌組織TUNEL典型圖Figure 2 The typical features of cardiomyocytes in aged rats by TUNEL

2.3 老年大鼠心肌組織caspase-3活性與心臟功能的關(guān)系

caspase-3活性與心肌收縮功能指標(biāo)CI呈負(fù)相關(guān)(r=－0.772，P＜0.01)，即隨著 caspase-3 活性的增高，CI降低。也就是說，caspase-3活性越高，大鼠心肌收縮功能越差，提示，老年大鼠心肌收縮功能下降可能與其凋亡水平增加有關(guān)(見圖4A)。caspase-3活性與心肌舒張功能指標(biāo)LVDP呈正相關(guān)(r=0.718，P＜0.01)，即隨著 caspase-3 活性增高，LVDP相應(yīng)增加，即caspase-3活性越高，心肌舒張功能越差，提示老年大鼠心肌舒張功能下降可能與其凋亡水平增加有關(guān)(見圖4B)。

2.4 給予廣譜的Caspase抑制劑Z-VAD-FMK阻斷大鼠心肌細(xì)胞凋亡，大鼠心臟功能改善

給予廣譜的caspase抑制劑Z-VAD-FMK后，測定大鼠心臟功能，結(jié)果表明:老年大鼠CI明顯升高［(39.23 ± 1.62)s－1vs(43.52 ± 2.42)s－1，P＜0.05］;LVDP［(0.16 ± 0.17)kPavs(－ 0.82 ±0.26)kPa，P＜ 0.05］和 LVEDP［(1.25 ±0.35)kPavs(0.32 ±0.18)kPa］均明顯降低(見圖 5)。提示經(jīng)過抗凋亡干預(yù)后，老年大鼠的心臟功能明顯改善。

圖3 老年大鼠心肌組織中凋亡情況的變化 (n=10)Figure 3 The apoptosis of cardiomyocytes in aged rats (n=10)

圖4 老年大鼠心肌組織caspase-3活性與其心功能的相關(guān)性分析 (n=10)Figure 4 The relationship between caspase-3 activity and cardiac function in aged rats (n=10)

圖5 廣譜Caspase抑制劑Z-VAD-FMK抑制凋亡后對老年大鼠心功能的影響 (n=10)Figure 5 The effects of Z-VAD-FMK on cardiac function in aged rats (n=10)

3 討論

心臟是生命的重要器官，伴隨增齡衰老，形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。本研究進(jìn)一步證實:老年大鼠心肌細(xì)胞丟失，心功能下降。我們的研究發(fā)現(xiàn)與成年大鼠心質(zhì)量相比，老年大鼠的心質(zhì)量顯著增加，但與成年大鼠的心質(zhì)量/體質(zhì)量相比，老年大鼠的心質(zhì)量/體質(zhì)量卻顯著下降，提示老年大鼠的心臟相對質(zhì)量明顯降低。而且，老年大鼠的心肌收縮及舒張功能均明顯低于成年大鼠。那么，這些現(xiàn)象的出現(xiàn)是否與細(xì)胞丟失，尤其是心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)呢?本研究進(jìn)一步檢測了老年大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況。

TUNEL染色是檢測細(xì)胞凋亡的一種較靈敏的方法，通過該方法分別對成年大鼠及老年大鼠心肌組織進(jìn)行檢測，并計數(shù)凋亡指數(shù)，本實驗的細(xì)胞凋亡學(xué)檢測結(jié)果顯示:老年組大鼠陽性染色的凋亡核明顯增加，凋亡指數(shù)較正常成年大鼠顯著增多(P＜0.01)。caspase-3是細(xì)胞凋亡最后通路的關(guān)鍵蛋白，其活性可以定量反映細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。為了更準(zhǔn)確地反映老年大鼠心肌組織的凋亡程度，本實驗配合檢測了老年大鼠心肌組織的caspase-3活性來共同說明心肌細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果表明，與成年大鼠相比，老年大鼠caspase-3的比活性顯著增高，較全面地反映了老年大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加。

那么，老年大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡是否是其心功能下降的重要因素?本研究進(jìn)一步觀察了心肌細(xì)胞凋亡程度與心功能的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):caspase-3活性與CI呈負(fù)相關(guān)，與LVDP呈正相關(guān)。也即隨著caspase-3活性增高，老年大鼠心肌收縮功能和舒張功能降低。這一結(jié)果提示老年大鼠心肌收縮和舒張功能的下降可能與其凋亡水平增加有關(guān)。

無論是內(nèi)源性還是外源性損傷信號均通過細(xì)胞表面受體激活從而引起細(xì)胞凋亡，這一途徑的關(guān)鍵步驟是caspase的激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，抑制caspase的活性是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要途徑。Z-VAD-FMK是一種廣譜的不可逆caspase抑制劑，可以在蛋白水平抑制caspase的酶活性。在本研究中為了進(jìn)一步證實心肌細(xì)胞凋亡在老年大鼠心功能下降中的作用，我們采用了廣譜的caspase抑制劑Z-VAD-FMK，抑制心肌細(xì)胞凋亡后發(fā)現(xiàn)，老年大鼠心臟的收縮和舒張功能均明顯改善，提示:心肌細(xì)胞凋亡在老年大鼠心功能下降中發(fā)揮著重要作用。

總之，心臟是人體的重要生命器官，其功能降低將對人體構(gòu)成嚴(yán)重影響。本實驗結(jié)果表明衰老可以引起心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能降低，提示臨床可以通過抗凋亡措施來減少心肌細(xì)胞丟失進(jìn)而延緩心功能的下降。

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