丁 瑜，付雪瓊，余長壽，楊 兵(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院消化內科，深圳 586;遵義醫(yī)學院珠海校區(qū);通訊作者，E-mail:yangbing6708@63.com)

研究發(fā)現(xiàn)主要的致癌信號通路最后都會匯聚到腫瘤細胞代謝上來，因為腫瘤細胞的代謝決定著腫瘤細胞的生長和存活，細胞代謝的改變可作為腫瘤的一個重要特點［1，2］。很多研究表明，去乙?；?(SIRT3)在腫瘤細胞代謝中發(fā)揮重要作用［3］。SIRT3是沉默信息調節(jié)因子相關酶家族(sirtiuns)的一員，顯著分布于細胞線粒體中，通過調控細胞葡萄糖的代謝，影響腫瘤細胞的新陳代謝，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關［4］。但SIRT3的表達與胃癌的關系尚不清楚，本研究采用Western blot和免疫組織化學的方法檢測胃癌組織和癌旁組織中SIRT3的表達情況，并探討其與臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 組織標本

收集深圳龍崗中心醫(yī)院及深圳市人民醫(yī)院2012－07～2012－12手術切除且病理資料完整的20例胃癌組織及癌旁組織(距手術切緣2－5 cm處正常胃組織)標本，所取組織置于液氮中保存24 h，后轉－80℃冰箱保存，采用Western blot方法檢測以上20例組織中SIRT3的表達。另外收集深圳龍崗中心醫(yī)院2006－03～2007－12手術切除后的胃癌蠟塊包埋標本30例，切緣組織為癌旁正常對照組，采用免疫組化方法檢測以上50例標本中SIRT3的表達，并分析其與胃癌病理特征的關系。所有標本術前均未行放化療，且病理診斷明確為胃癌。免疫組化標本中男42例，女8例;年齡 30－82歲，平均年齡(60.9±12.3)歲;按照國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(UICC/AJCC，2010)胃癌 TNM 分期:Ⅰ－Ⅱ期 22例，Ⅲ－Ⅳ期28例;有淋巴結轉移34例，無淋巴結轉移16例;高、中分化胃癌24例，低分化胃癌26例。

1.2 材料

SIRT3兔抗人單克隆抗體、鼠抗人單克隆β-actin抗體購自Cell Signaling Technology，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 Western blot 取保存于－80℃冰箱的組織樣本，用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液，100℃煮沸5－10 min變性，12.5%的分離膠進行SDS-PAGE電泳，每孔上樣總蛋白約30 μg左右，后進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜后加入SIRT3及β-actin抗體，用5%BSA稀釋，稀釋比例均為1∶1 000，4℃搖床過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1 h，運用ECL試劑盒(Milipore公司)發(fā)光、顯影、定影、沖洗晾干、拍照并成像分析。

1.3.2 免疫組織化學 采用免疫組化Max Vision二步法，具體步驟嚴格按免疫組化化學試劑盒說明書進行操作，DAB染色，蘇木素復染后中性樹膠封片。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，已證實的SIRT3染色陽性的切片作陽性對照。

1.4結果判定

1.4.1 Western blot結果判斷 運用 Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值，將SIRT3/β-actin的比值作為蛋白表達的相對量。

1.4.2 免疫組化結果判斷［5］所有切片采用雙盲法由2－3位有經驗的病理科醫(yī)師閱片。SIRT3染色陽性表達位于胞質內，呈清晰棕黃色顆粒。每張切片隨機觀察5個高倍視野，判斷標準根據(jù)顯色細胞數(shù)和顯色強度兩個方面來評估。按顯色細胞數(shù)評分:未見顯色細胞為0分;細胞顯色比例＜50%為1分;細胞顯色比例≥50% 為2分。按顯色強度計分:無細胞顯色為0分，呈淡黃色為1分，呈棕黃色為2分。兩者積分乘積＜2分表示陰性，≥2分表示陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對Western blot檢測的蛋白相對表達量運用t檢驗，免疫組化測定結果進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot檢測SIRT3在胃癌組織中的表達

免疫印跡法結果顯示，SIRT3在胃癌中表達陽性率為35%，其在胃癌組織中的表達水平明顯低于其對應的癌旁正常胃組織，SIRT3在胃癌中的表達水平(0.960±0.126)較胃癌癌旁組織的表達水平(1.932 ±0.130)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見圖1)。

圖1 Western blot檢測SIRT3在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達Figure 1 The expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues by Western blot

2.2 免疫組化檢測SIRT3在胃癌組織中的表達

免疫組化染色結果顯示，SIRT3在胃癌細胞中的表達主要位于細胞質內(圖2)，并且在胃癌組織中的表達陽性率為34%，明顯低于癌旁正常胃組織(64%，P＜0.05，見表1)。

圖2 SIRT3在胃癌組織及癌旁組織中的表達 (Max Vision法，×200)Figure 2 The expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues by immunochemistry(Max Vision，×200)

表1 SIRT3在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達 (例)Table 1 Expression of SIRT3 protein in gastric carcinoma tissues and peripheral normal tissues (cases)

2.3 SIRT3的表達與臨床各病理特征的關系

SIRT3在胃癌組織中的表達與年齡、性別、淋巴結轉移無相關性(P＞0.05)，但與浸潤深度、分化程度及TNM分期有關(P＜0.05，見表2)。

3 討論

SIRT3是沉默信息調節(jié)因子相關酶家族(sirtiuns)成員之一，sirtiuns家族被認為是Ⅲ類組織蛋白去乙?；?HDAC)，該家族蛋白在進化上高度保守，已經成為對衰老和長壽有重要作用的調控因子，它們通過NAD+依賴的酶催化活性，在細胞代謝、抗逆性、細胞增殖、存活和凋亡等過程起重要作用［6］。SIRT3是線粒體中主要的去乙?；?，具有去乙酰基酶活性，定位在11號染色體(11p15.5)，基因長度21 kb，在肌肉、肝臟、心臟和褐色脂肪組織等代謝活動活躍的組織中高表達［7］。研究表明，腫瘤細胞主要通過葡萄糖的有氧糖酵解為細胞增殖、分化提供能量［4］，而SIRT3正是以新陳代謝的許多酶類作為發(fā)揮去乙酰化作用的靶點，進而激活有氧代謝路徑，影響腫瘤細胞的能量代謝［6］。目前大多數(shù)研究認為，SIRT3通過多種細胞代謝通路調控腫瘤細胞的代謝和生長，發(fā)揮腫瘤抑制的作用［8，9］。

表2 胃癌SIRT3的表達與臨床病理特征的關系 (例)Table 2 The relationship between clinical pathological features of gastric carcinoma and the expression of SIRT3 (cases)

我們的研究結果顯示，胃癌組織中SIRT3表達的陽性率明顯低于癌旁正常組織，SIRT3在胃癌組織中呈低水平表達。雖然SIRT3在胃癌組織中低表達的機制尚不清楚，但已有研究［8，10］發(fā)現(xiàn)，SIRT3 在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、睪丸癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌和腎透明細胞癌中表達也明顯降低。最近Zhang等［11］也通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3在原發(fā)性肝癌組織中低表達，并且SIRT3的過度表達能抑制肝癌細胞的生長，以上文獻研究結果均與我們的研究結論一致。

同時Zhang等還發(fā)現(xiàn)SIRT3在肝癌細胞中的表達水平與患者的AFP值、腫瘤多發(fā)性、分化程度、臨床分期以及有無復發(fā)呈顯著相關性。為進一步探討SIRT3在胃癌的發(fā)展進程中的作用，我們分析了SIRT3的表達與臨床病理因素的關系，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3的表達與胃癌的浸潤深度、分化程度、臨床分期有關，浸潤胃組織越深，SIRT3的表達越低;分化程度高較分化程度低的胃癌組織中，SIRT3的表達水平較高;臨床分期越晚，SIRT3的表達水平越低，其差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。提示SIRT3的表達與胃癌細胞的侵襲能力、惡性程度有相關性，可能為臨床上檢測SIRT3的表達水平評估胃癌的惡性程度提供一定的理論基礎。

綜上所述，SIRT3與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，SIRT3在胃癌發(fā)生、發(fā)展方面可能發(fā)揮重要作用，SIRT3的表達與分化程度、浸潤深度、臨床分期有相關性，檢測SIRT3蛋白的表達水平可能作為評估胃癌惡性程度的的一項重要指標。

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