姚曉偉，潘軍強，周 鑫，韓穩(wěn)琦，李國良(陜西省人民醫(yī)院心臟內(nèi)二科，西安 70068;西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科;通訊作者，E-mail:xiaowei_yao@cn.com)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)相關疾病是目前人群死亡的首位原因，在我國發(fā)病率、致殘率和死亡率呈逐年上升趨勢，目前公認為AS是一種大、中型動脈血管的慢性非特異性炎癥病變［1］。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類依賴于鋅、鈣離子的內(nèi)肽酶［2］，至少已發(fā)現(xiàn)有23個成員［3］，MMP-9是其家族成員之一。相關研究報道，MMP-9可能通過炎癥反應促進動脈粥樣硬化斑塊破裂［4］，在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［5］。吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物，是近年來備受推崇的一類治療糖尿病的新藥，相關研究表明其可通過激動過氧化物酶體增殖物激活受體-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)而抑制許多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出抗AS作用［6－9］。本研究以 AS易感動物，遺傳性高脂血癥(Watanabe heritable hyperlipidemic，WHHL)兔為研究對象，給予高膽固醇飲食同時建立動脈粥樣硬化模型后觀察新型噻唑烷二酮類藥物鹽酸吡格列酮對兔動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)MMP-9表達的影響，探討噻唑烷二酮類藥物抗動脈粥樣硬化的作用機制，為此類藥物用于人類動脈粥樣硬化的預防和治療提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

本組選擇新西蘭兔36只，雄性，1月齡，體重1.3－1.6 kg，購自西安交通大學實驗動物中心。將兔實驗室適應性喂養(yǎng)普通飼料1周后，稱重，隨機分為3組:正常對照組12只，飼喂正常飼料120 g/d;高膽固醇飲食組12只，飼喂高膽固醇飼料120 g/d;高膽固醇飲食加吡咯列酮組12只，高膽固醇飼料120 g/d+吡格列酮8 mg/(kg·d)灌胃，喂養(yǎng)8周后處死各組動物。高膽固醇飼料按照西方飲食飼料配方:膽固醇2%，蛋黃粉5%，豬油8%，基礎飼料85%。鹽酸吡格列酮片(瑞彤)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批準文號:國藥準字H20040631，15 mg/片。生產(chǎn)批號:08042151。

1.2 試劑及儀器

基質(zhì)金屬蛋白酶－9抗體(anti-MMP-9)，產(chǎn)品規(guī)格:濃縮液(1 mg/ml)親和純化抗體，產(chǎn)品編號:bs-0397R，北京博奧森生物技術有限公司。PV-6000通用型二步法免疫酶標組織化學染色檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司。0.01 mol/L PBS緩沖液，北京中杉金橋生物技術有限公司。0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，北京中杉金橋生物技術有限公司。光學顯微鏡(BX-51型)OLYMPUS，Japan。病理圖文分析系統(tǒng)PIPS2000，重慶天海醫(yī)療設備有限公司。

1.3 標本取材及留取

以上各組實驗動物分別在預定實驗終點給予耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg全身麻醉后左心室取血5 ml并注入空氣20 ml空氣栓塞處死動物。血液注入不含抗凝劑普通試管，靜置后離心分離血清。立即開胸并剪開右心房，自左心室灌注福爾馬林固定主動脈;分離主動脈，取出從近主動脈弓部到髂動脈分叉處全部主動脈，清除血管外組織，生理鹽水沖洗，置于中性甲醛緩沖液中固定。

1.4 HE染色及Masson染色鏡下觀察

對各組兔的主動脈進行HE染色，鏡下觀察病理切片形態(tài)，泡沫細胞數(shù)量及形態(tài)，纖維帽形成，膠原纖維增殖及融合，病灶深部可見壞死崩潰物等情況，從HE染色片上隨機選取5個視野，利用朗珈PAS9000病理分析系統(tǒng)對主動脈內(nèi)膜、中膜厚度及內(nèi)膜/中膜(IMT)進行測量。通過Masson染色觀察動脈硬化分級:0級，正常血管;1級，少于50%的外膜受累，內(nèi)膜增生占管腔不超過20%;2級，50%－100%的外膜受累輕度纖維化，內(nèi)膜增生不超過管腔的20%;3級，100%外膜受累，中度纖維化，內(nèi)膜增生占管腔的20%－50%;4級，100%外膜受累，重度纖維化，內(nèi)膜增生達管腔的50%－80%;5級，全部管腔閉鎖。

1.5 MMP-9免疫組化特異性染色鏡下觀察

免疫組織化學染色法觀察主動脈血管內(nèi)皮MMP-9表達。結(jié)果判定:MMP-9陽性表達為細胞質(zhì)內(nèi)或細胞膜棕黃色顆粒，隨機選取4個視野，200倍鏡下觀察，圖像分析采用病理組織實時攝像顯微鏡系統(tǒng)攝像，并使用圖像分析軟件分析陽性面積百分比。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 三組間動脈壁及AS斑塊HE染色的比較

正常對照組動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積或斑塊形成。高膽固醇飲食組，主動脈內(nèi)皮細胞明顯減少，內(nèi)膜顯著增厚，內(nèi)膜下的脂質(zhì)沉積明顯，脂質(zhì)斑塊及纖維帽形成，纖維帽下可見大量壞死崩解物質(zhì)，斑塊底部少量肉芽組織，少量淋巴細胞及泡沫細胞，血管平滑肌排列紊亂，中膜因斑塊壓迫、SMC萎縮，彈力纖維破壞變薄。高膽固醇飲食加吡咯列酮組主動脈板塊表面大量SMC和細胞外基質(zhì)構(gòu)成的纖維帽，其下可見數(shù)量不等的泡沫細胞及炎細胞，內(nèi)皮細胞輕度減少;內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜下有脂質(zhì)沉積，可見血管平滑肌細胞增生，排列較規(guī)整，核略腫脹，彈力纖維、膠原纖維輕度增生(圖1)。

圖1 不同組別動脈壁及動脈粥樣硬化斑塊HE染色 (×100)Figure 1 Hematoxylin staining of arterial wall and aortic AS plaque in three groups (HE，×100)

2.2 三組間動脈壁及AS斑塊Masson染色比較

正常對照組動物主動脈硬化為0級，高膽固醇飲食組動物主動脈硬化4級以上，高膽固醇飲食加吡咯列酮組主動脈硬化3－4級(圖2)。

圖2 動脈壁及動脈粥樣硬化斑塊Masson染色 (×100)Figure 2 Masson staining of arterial wall and aortic AS plaque in three groups (Masson staining，×100)

2.3 三組間MMP-9特異性染色表達陽性面積比比較

高膽固醇飲食加吡咯列酮組、高膽固醇飲食組MMP-9陽性面積比(陽性染色面積/斑塊總面積)明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);高膽固醇飲食加吡咯列酮組MMP-9陽性面積比明顯低于高膽固醇飲食組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見表1，圖3)。

圖3 動脈壁及動脈粥樣硬化斑塊MMP-9表達 (×200)Figure 3 Expression of MMP-9 in aortic AS plaque area in three groups (immunohistochemical staining，×200)

表1三組間動脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達陽性面積比(±s，%)Table 1MMP-9 positive area ratio in aortic AS plaque area(±s，%)

表1三組間動脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達陽性面積比(±s，%)Table 1MMP-9 positive area ratio in aortic AS plaque area(±s，%)

與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與高膽固醇飲食組比較，#P＜0.05

組別 n 粥樣斑塊MMP-9表達陽性面積比正常對照組12 0.00 ±0.00高膽固醇飲食組 12 49.17 ±9.12＊＊高膽固醇飲食加吡格列酮組 12 39.17 ±3.52＊＊#

3 討論

研究表明，MMP-9在不穩(wěn)定斑塊中特別是易發(fā)生破裂的斑塊肩部區(qū)域含量較高，酶活性明顯增高，是造成不穩(wěn)定斑塊破裂的主要因素［10，11］。MMP-9是很多生理過程的關鍵調(diào)節(jié)劑，病理情況下MMP-9被激活，其表達上調(diào)，在動脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展及破裂中發(fā)揮重要作用，這主要通過血管中膜平滑肌細胞遷移、增殖、凋亡及細胞外基質(zhì)的重塑實現(xiàn)的。

大量的實驗表明，PPAR-γ及其配體在巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞中均有表達，具有直接的血管效應，激活后可直接在血管壁水平拮抗上述病理作用。吡格列酮是人工合成特異性PPAR-γ激動劑，也是臨床上用于治療2型糖尿病的口服降糖藥，近年來的研究表明，吡格列酮抗動脈粥樣硬化的直接效應包括增加一氧化氮的生物利用度，減少白細胞和內(nèi)皮細胞的相互作用，減少血管平滑肌細胞的遷移和增殖及巨噬細胞中膽固醇的外流［12］。此外，PPAR-γ激活后也可通過脂肪組織間接調(diào)控基因表達發(fā)揮抗炎作用。

相關研究證實，吡格列酮可劑量依賴性抑制單核細胞源的巨噬細胞MMP-9的mRNA及其蛋白的表達和活性［13］;羅格列酮對糖尿病合并冠心病患者的血漿MMP-9水平有明顯降低作用［14］。本實驗結(jié)果顯示，正常新西蘭兔進食高膽固醇飼料后，主動脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達陽性面積比明顯升高，高膽固醇飲食加吡咯列酮組粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達陽性面積少于高膽固醇飲食組。即預防性服用吡格列酮可在一定程度上使主動脈粥樣斑塊內(nèi)MMP-9表達陽性面積水平下調(diào)。這與目前的相關報道一致，隨著對AS發(fā)病機制分子水平研究的不斷深入，有關吡格列酮對MMP-9的影響及在抗AS中的作用將成為新的研究熱點。

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