郝永壯，張宇明，蘇云星，宋潔富，常保國，王小健，劉建榮，秦 琴(山西省人民醫(yī)院急診科，太原

關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管、神經(jīng)分布，其損傷后自身修 復(fù)能力有限，目前尚無結(jié)構(gòu)、成分、生物學(xué)特性與正常軟骨類似的軟骨缺損修復(fù)組織。因此修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損仍是臨床上的難題之一。目前臨床上運(yùn)用的多種軟骨修復(fù)方法，如軟骨下骨鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)、骨膜移植術(shù)等，多以纖維樣修復(fù)為主。近幾年來，三維立體生物修復(fù)材料的研制及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的提高為軟骨組織工程修復(fù)的臨床應(yīng)用展示了廣闊的前景。之前已經(jīng)有人用過海藻酸鈉［1］、去端肽膠原［2］、Plruonic F127［3］、聚乙醇酸－乳酸共聚物(PLGA)［4］等支架材料作為載體，復(fù)合軟骨細(xì)胞或者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，并取得了一定的研究成果。目前，同種異體軟骨細(xì)胞復(fù)合人胎盤Ⅰ型膠原蛋白海綿是否能達(dá)到軟骨缺損的透明樣軟骨修復(fù)，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究就是探討該復(fù)合物修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性，為組織工程化軟骨在臨床修復(fù)軟骨缺損提供一條新的途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2周齡新西蘭兔1只，8月齡54只，由山西省畜牧養(yǎng)殖中心提供。Pronase酶、Ⅱ型膠原酶、Dispase酶購自美國Sigma公司，DMEM-F12培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。Ⅱ型膠原單克隆抗體(鼠抗兔)和二抗(羊抗鼠)購自德國Merke公司。人胎盤Ⅰ型膠原蛋白海綿購自上海其勝制劑實(shí)業(yè)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和傳代 銳刀刮取2周齡乳兔關(guān)節(jié)軟骨，加入0.4%Pronase酶，在37℃ CO2培養(yǎng)箱消化90 min后，加入0.025%Ⅱ型膠原酶消化過夜得到原代軟骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)、離心、接種，并體外培養(yǎng)約兩周至第2代。

1.2.2 軟骨細(xì)胞與支架材料的結(jié)合 將人胎盤Ⅰ型膠原蛋白海綿用角膜環(huán)鉆做成直徑約4 mm的圓形小塊后酒精浸泡過夜，無菌 PBS沖洗3次，15 min/次，然后于24孔培養(yǎng)板中DMEM浸泡過夜。選擇生長狀態(tài)良好的第2代軟骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)，臺盼藍(lán)染色保證細(xì)胞存活率≥80%，加入DMEM液配制成濃度為1.2×107個(gè)/ml，與制作好的蛋白海綿小圓塊復(fù)合，置入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h。

1.2.3 動物模型制備 取雄性八月齡新西蘭兔54只，體重4.0－4.5 kg，平均 4.28 kg，隨機(jī)分為3 組，每組18只。首先用3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)靜脈注射麻醉，常規(guī)消毒，鋪無菌巾，以髕骨中點(diǎn)為中心，沿膝外側(cè)緣做縱行切口約5 cm，逐層切開。將髕骨向內(nèi)側(cè)牽拉顯露股骨髁，于股骨髁間窩以直徑3.8 mm牙科電鉆做一深約2 mm的全層軟骨缺損模型。實(shí)驗(yàn)組分別植入軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞+支架材料復(fù)合物后，縫合周圍骨膜覆蓋缺口。對照組于軟骨缺損處單純縫合周圍骨膜覆蓋缺口。術(shù)區(qū)無菌生理鹽水充分沖洗后，髕骨復(fù)位，逐層縫合關(guān)節(jié)囊、皮下組織及皮膚。術(shù)后膝關(guān)節(jié)不固定，置兔籠養(yǎng)，允許其自由活動。

1.2.4 大體觀察 分別于術(shù)后12，24，36周每組各處死6只動物，取出手術(shù)區(qū)域組織，觀察缺損區(qū)修復(fù)情況。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 將標(biāo)本于甲醛液中固定，EDTA脫鈣，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片(5 μm)后行HE染色、甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察。

1.2.6 主要觀察指標(biāo) 各組膝關(guān)節(jié)股骨端標(biāo)本大體及組織學(xué)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

對照組:12周時(shí)修復(fù)組織為纖維樣修復(fù)，表面欠光滑，光澤差，缺損區(qū)部分凹陷。24周時(shí)仍為纖維樣修復(fù)，可見有空洞形成，與正常軟骨界限清楚。36周時(shí)修復(fù)區(qū)呈退行性改變，空洞直徑變大，與正常組織界限明顯，周圍關(guān)節(jié)軟骨亦呈退行性改變。

軟骨細(xì)胞組:術(shù)后12周缺損區(qū)部分填充，修復(fù)組織呈半透明乳白色，結(jié)構(gòu)相對粗糙，可見多數(shù)針尖樣結(jié)構(gòu)，與周圍軟骨界限明顯。24周，缺損區(qū)表面光滑，可見較多白色組織形成，透明度較前降低，呈半軟骨半纖維樣結(jié)構(gòu)，與周圍軟骨結(jié)合較好，但仍存在部分缺損未修復(fù)。36周，缺損區(qū)已完全填充，填充組織與正常軟骨相比，色澤稍偏黃，透明度較前更低，呈纖維樣結(jié)構(gòu)。

軟骨細(xì)胞+支架材料組:術(shù)后12周修復(fù)組織多與軟骨面平，缺損區(qū)表面相對光滑，但不完整，色澤不均。部分修復(fù)區(qū)輪廓模糊不清，部分界限可見。24周，缺損區(qū)可見較明顯的半透明白色組織覆蓋，表面較光滑，有一定光澤，與周圍正常軟骨有較好吻合。36周，缺損區(qū)修復(fù)組織類似于正常的透明關(guān)節(jié)軟骨，呈淡藍(lán)色，表面光滑有光澤，與周圍軟骨連接緊密(圖1)。

圖1 不同組別在不同時(shí)間的大體觀察Figure 1 Gross specimen at different time in three groups

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

對照組:12周時(shí)修復(fù)區(qū)可見纖維組織填充，組織中含少量纖維樣細(xì)胞，深層有少量再生軟骨組織，形態(tài)凹陷且不規(guī)則，HE染色可見到不同于周圍正常軟骨的新生組織，蛋白多糖沉積較少，Ⅱ型膠原染色可見少量黃染顆粒(圖2)。24周時(shí)修復(fù)區(qū)呈纖維軟骨修復(fù)，表層不平整，呈蟲蝕樣改變，修復(fù)組織中細(xì)胞較少，周圍軟骨退變明顯。缺損處甲苯胺藍(lán)及免疫組化染色未見明顯的蛋白多糖和Ⅱ型膠原沉積(圖3)。36周時(shí)可見缺損處表層組織不完整，更多空洞形成，HE染色表明新生組織由纖維樣細(xì)胞組成，有少量的蛋白多糖分泌，Ⅱ型膠原表達(dá)陰性，黃染出現(xiàn)很少(圖4，見封3)。

圖2 不同組別術(shù)后12周組織切片染色 (bar=100 μm)Figure 2 Histomorphology of cartilage tissues in defects at week 12 after surgery in three groups (bar=100 μm)

軟骨細(xì)胞組:12周時(shí)缺損區(qū)部分填充，新生軟骨呈邊緣不規(guī)則的小蜂窩狀結(jié)構(gòu)，軟骨細(xì)胞周圍可見軟骨陷窩形成。HE染色可見軟骨細(xì)胞呈橢圓形，排列不規(guī)整。甲苯胺藍(lán)及免疫組化染色提示新生軟骨細(xì)胞可表達(dá)少量蛋白多糖及Ⅱ型膠原(圖2)。24周時(shí)缺損區(qū)相對平整，新生組織由不典型軟骨細(xì)胞及多角形纖維樣細(xì)胞組成，橫向排列，未見軟骨陷窩。甲苯胺藍(lán)染色可見新生軟骨細(xì)胞被染成棕紅色，周圍可見甲苯胺藍(lán)變色反應(yīng)的軟骨基質(zhì)，細(xì)胞分布也較不均勻。免疫組化染色可見胞內(nèi)少量黃褐色顆粒，說明新生組織表達(dá)蛋白多糖及Ⅱ型膠原進(jìn)一步減少(圖3)。36周時(shí)，缺損區(qū)除少量未修復(fù)外，大部由纖維組織填充，組織中含大量纖維樣細(xì)胞，HE染色表明修復(fù)組織為與周圍正常軟骨組織異源性的組織，甲苯胺藍(lán)及免疫組化染色表明修復(fù)區(qū)無蛋白多糖及Ⅱ型膠原沉積(圖4，見封3)。

圖3 不同組別術(shù)后24周組織切片染色 (bar=100 μm)Figure 3 Histomorphology of cartilage tissues in defects at week 24 after surgery in three groups (bar=100 μm)

軟骨細(xì)胞+支架材料組:12周時(shí)缺損處相對平整，有部分軟骨陷窩形成以及分布不均的類軟骨樣細(xì)胞。HE染色可見修復(fù)組織為與周圍組織同源的正常組織。甲苯胺藍(lán)染色可見修復(fù)區(qū)有一定量的蛋白多糖沉積。Ⅱ型膠原表達(dá)呈弱陽性，黃染細(xì)胞不多，出現(xiàn)少量黃褐色顆粒(圖2)。24周時(shí)新生軟骨層更加規(guī)整，表層軟骨細(xì)胞呈扁平狀，橫向排列，深層軟骨細(xì)胞多呈圓形放射狀排列，可見軟骨陷窩形成。移植物與缺損底部直接接觸的區(qū)域由于發(fā)生了骨化而成為軟骨下骨，然而新生軟骨層與正常軟骨層相比厚度較薄，且與臨近正常軟骨間多存在裂隙，無完整的潮線形成。甲苯胺藍(lán)染色著色較深提示有更多的蛋白多糖沉積，免疫組織化學(xué)染色可見較多黃褐色顆粒，說明基質(zhì)中有更多的 II型膠原生成(圖3)。36周時(shí)修復(fù)區(qū)細(xì)胞排列接近正常透明軟骨組織，表層完整光滑，可見軟骨細(xì)胞呈典型球形放射狀排列，并形成軟骨陷窩，與鄰近正常軟骨組織愈合良好。軟骨下骨進(jìn)一步增多，可見完整潮線形成。甲苯胺藍(lán)染色表明缺損處有大量的蛋白多糖沉積，細(xì)胞中及細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原表達(dá)陽性，出現(xiàn)大量黃褐色或棕黃色顆粒(圖4)。

圖4 不同組別術(shù)后36周組織切片染色 (bar=100 μm)Figure 4 Histomorphology of cartilage tissues in defects at week 36 after surgery in three groups (bar=100 μm)

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)一直是骨科臨床研究的熱點(diǎn)。研究表明，單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞有去分化傾向，易形成纖維組織并喪失聚集細(xì)胞外基質(zhì)的能力［5－7］，并且隨著關(guān)節(jié)運(yùn)動植入的細(xì)胞有可能溢出缺損區(qū)，因而有學(xué)者開始利用組織工程學(xué)的方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷。

運(yùn)用組織工程方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，主要涉及以下幾個(gè)方面:種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子。種子細(xì)胞可以是自體或異體來源的軟骨細(xì)胞以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。支架材料多為具有良好生物相容性的生物材料，可以保證種子細(xì)胞很好地附著在其表面，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和活性的穩(wěn)定［8］。既可以為種子細(xì)胞生長提供三維空間，也可以為其提供細(xì)胞外基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)［9］。支架材料的性能對種子細(xì)胞的增殖、分化及表型的維持有重要影響［10］。

目前，在組織工程研究中，多選用同種異體的軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，因?yàn)槠鋪碓捶奖?，可以于短期?nèi)獲得大量細(xì)胞。因此，本研究采用同種異體軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞。軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代的過程中，會逐漸出現(xiàn)表型的變化，即軟骨細(xì)胞合成、分泌Ⅱ型膠原及糖胺多糖減少，而Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成和分泌增多。這種失去特異性表型的現(xiàn)象稱為軟骨細(xì)胞的去分化。研究［11］表明，第2代軟骨細(xì)胞無論在表型的維持上還是增殖能力方面均為最佳。本實(shí)驗(yàn)選用的人胎盤Ⅰ型膠原蛋白海綿支架，其孔徑約為25－100 μm，作為一種小孔徑的支架材料，具有吸附細(xì)胞能力強(qiáng)、生物相容性好及降解性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的優(yōu)良載體。因此，本研究以體外培養(yǎng)第2代軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，復(fù)合人胎盤Ⅰ型膠原蛋白海綿支架修復(fù)兔股骨髁間窩全層軟骨缺損。

黃永波等［1］運(yùn)用同種異體軟骨細(xì)胞復(fù)合海藻酸鈉在體外聯(lián)合培養(yǎng)4周形成組織工程軟骨后植入兔股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨缺損處，術(shù)后24周發(fā)現(xiàn)新生軟骨組織與正常軟骨顏色接近，表面完整光滑，軟骨下骨也得以重建，但缺乏正常軟骨的分層結(jié)構(gòu)，修復(fù)組織與鄰近正常軟骨之間多存在裂隙。姜洪豐等［2］則采用體外培養(yǎng)2周的同種異體軟骨細(xì)胞與去端肽膠原凝膠復(fù)合，植于兔膝關(guān)節(jié)股骨髁間窩全層軟骨缺損處，結(jié)果顯示，術(shù)后8周缺損區(qū)由具有一定彈性和韌性的軟骨樣組織填充，與周圍正常軟骨界限模糊，可見軟骨陷窩底部細(xì)胞密集。Ochi等［12］運(yùn)用人自體軟骨細(xì)胞復(fù)合膠原前體凝膠(atelocolagengel)體外培養(yǎng)，用于臨床上膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損的患者，缺損區(qū)新生軟骨的生物力學(xué)研究表明，其力學(xué)特性與正常軟骨相似。本研究中，我們選擇同種異體軟骨細(xì)胞復(fù)合已商品化的支架材料人胎盤Ⅰ型膠原蛋白海綿修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)股骨髁間窩全層軟骨缺損。制作軟骨缺損模型時(shí)，缺損未超過軟骨下骨(深約2 mm)，因?yàn)槿羧睋p超過軟骨下骨，有自行修復(fù)的可能［13］。

本研究結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞+支架材料組術(shù)后12周缺損區(qū)有類軟骨樣細(xì)胞及軟骨陷窩形成，甲苯胺藍(lán)染色可見新生類軟骨樣細(xì)胞分泌的膠原被染成紅色。Ⅱ型膠原表達(dá)呈弱陽性，黃染細(xì)胞不多，出現(xiàn)少量黃褐色顆粒。術(shù)后24周缺損區(qū)表層軟骨細(xì)胞呈扁平狀，橫向排列，深層軟骨細(xì)胞多呈圓形放射狀排列，可見軟骨陷窩及軟骨下骨形成。與正常軟骨比較，新生軟骨層厚度較薄，且與臨近正常軟骨間多存在裂隙，無完整的潮線形成。術(shù)后36周缺損區(qū)細(xì)胞排列接近正常透明軟骨組織，表層完整光滑，可見軟骨細(xì)胞呈典型球形放射狀排列，并形成軟骨陷窩，與鄰近正常軟骨組織愈合良好。軟骨下骨進(jìn)一步增多，可見完整潮線形成。軟骨細(xì)胞組術(shù)后12周缺損區(qū)部分填充，新生軟骨呈邊緣不規(guī)則的小蜂窩狀結(jié)構(gòu)，甲苯胺藍(lán)及免疫組化染色提示新生軟骨細(xì)胞可表達(dá)少量蛋白多糖及Ⅱ型膠原。24周缺損區(qū)相對平整，新生組織由不典型軟骨細(xì)胞及多角形纖維樣細(xì)胞組成，甲苯胺藍(lán)及免疫組化染色提示新生組織表達(dá)蛋白多糖及Ⅱ型膠原進(jìn)一步減少。36周缺損區(qū)除少量未修復(fù)外，大部由纖維組織填充，組織中含大量纖維樣細(xì)胞。對照組隨著缺損修復(fù)時(shí)間的延長，出現(xiàn)越來越明顯的纖維樣修復(fù)表現(xiàn)。

可以發(fā)現(xiàn)，隨著組織工程化軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損時(shí)間的延長，出現(xiàn)越來越明顯的透明樣軟骨修復(fù)表現(xiàn)，蛋白多糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，去分化現(xiàn)象不明顯。而單純軟骨細(xì)胞組則出現(xiàn)較明顯的去分化表現(xiàn)，并最終導(dǎo)致纖維組織樣修復(fù)。對照組由于沒有細(xì)胞的填充，僅靠自身修復(fù)，僅出現(xiàn)不完全的纖維組織樣修復(fù)表現(xiàn)。

綜上所述，同種異體軟骨細(xì)胞復(fù)合人胎盤Ⅰ型膠原蛋白海綿可以較好地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，其所形成的新生軟骨組織，具有關(guān)節(jié)透明軟骨的特性。

［1］ 黃永波，衛(wèi)小春，翁習(xí)生，等.海藻酸鈉－成年軟骨細(xì)胞培養(yǎng)移植修復(fù)成年兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21(8):988－991.

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