劉 潔

(1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430071;2.湖北科技學(xué)院護(hù)理學(xué)院)

Histatin5(HST5)能有效殺滅耐藥的白色念珠菌，是極具潛力的防治口腔疾病藥物［1］。因唾液中HST5含量低微，不易提取;化學(xué)合成成本高。利用基因工程生產(chǎn)HST5值得嘗試。

大腸桿菌是常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，但表達(dá)量受多種因素影響［2］，需優(yōu)化表達(dá)條件以提高表達(dá)量。本文擬優(yōu)化部分表達(dá)條件，提高突變體HST5與谷光甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(GST-HST5)在大腸桿菌BL21中的表達(dá)量，為獲取重組HST5奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

含重組質(zhì)粒(插入HST5突變體)的大腸桿菌BL21(BL21-pGEX4T-2-hst5)及含空質(zhì)粒pGEX4T-2的BL21(BL21-pGEX4T-2)由湖北科技學(xué)院生化教研室提供。

1.1.2 主要試劑

IPTG為 TaKaRa公司產(chǎn)品，Yeast Extract、Tryptone為Oxiod公司產(chǎn)品，水為MilliQ超純水，蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品，氨芐青霉素(Amp)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、DTT、PMSF、Triton-X 100購(gòu)自上海生工生物公司。

1.2 方法

1.2.1 重組融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

將BL21菌液劃線于 LB固體平板，BL21-pGEX4T-2、BL21-pGEX4T-2-hst5菌液劃線于含100μg/ml Amp的 LB(下稱 LBAmp)固體平板，37℃，倒置培養(yǎng)12h。將BL21單菌落接種于LB中，BL21-pGEX4T-2、BL21-pGEX4T-2-hst5單菌落接種于 5ml LBAmp中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600 0.6，于 BL21-pGEX4T-2、BL21-pGEX4T-2-hst5菌液中加入終濃度0.5mmol/L IPTG，培養(yǎng)4h。5000rpm，室溫離心5min，棄上清，PBS重懸沉淀一次，離心，棄上清，于沉淀中加入300μl破菌緩沖液(含 1 × PBS、10mM DTT、1 mM PMFS、1%Triton-X 100)。按40W 功率，超聲5s，間歇5s的程序，冰浴超聲30min。5000rpm，4℃ 離心5min，取上清 240μl，加 80μl 4 × Loading Buffer，混勻，100℃ 變性10min，短暫離心，備用。

取樣品各10μl，上樣于15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，以預(yù)染蛋白Marker作蛋白分離程度的指示劑，待10KD Marker距凝膠底部約5mm時(shí)停止電泳。卸膠，加考馬斯亮藍(lán)浸泡凝膠，振蕩，染色1h?；厥杖旧?，加脫色液脫色至條帶清晰、無(wú)藍(lán)色背景，掃描拍照。

1.2.2 IPTG誘導(dǎo)濃度

確認(rèn)融合蛋白表達(dá)成功后，取5支試管，各加入5ml LBAmp，接種BL21-pGEX4T-2-hst5單菌落，37℃，培養(yǎng)至 OD600 0.6，依次加入0.2、0.6、1.0、1.5、2mmol/L IPTG，培養(yǎng)4h。按1.2.1提取蛋白、電泳、染色、脫色、掃描。

1.2.3 誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間

以1.2.2獲得的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度，誘導(dǎo)后依次培養(yǎng)2、4、6、8、10、12h，按1.2.1 提取蛋白、電泳、染色、脫色、掃描。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白成功表達(dá)

由圖1知，4泳道有一分子量較空載體表達(dá)的GST(26KD)略大的蛋白(箭頭示)，與融合蛋白GST-HST5分子量(29KD)相符，表明融合蛋白表達(dá)成功。

圖1 SDS-PAGE檢測(cè)重組融合蛋白的表達(dá)

2.2 IPTG誘導(dǎo)濃度

由圖2知，IPTG濃度在1.0mmol/L內(nèi)，融合蛋白表達(dá)量隨IPTG濃度升高而增加;濃度大于1.0mmol/L時(shí)，隨IPTG濃度升高，融合蛋白表達(dá)量有下降趨勢(shì)(箭頭示)。

圖2 IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)表達(dá)量的影響

2.3 誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間

由圖3可見，在誘導(dǎo)后6h內(nèi)，融合蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加;誘導(dǎo)時(shí)間超過6h后，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，融合蛋白表達(dá)量明顯下降(箭頭示)。

圖3 誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間對(duì)表達(dá)量影響明顯。誘導(dǎo)后6h內(nèi)，菌體生長(zhǎng)旺盛，表達(dá)外源蛋白的能力強(qiáng)，此段時(shí)間內(nèi)表達(dá)量上升與菌體總量增長(zhǎng)成正相關(guān);隨著時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)基逐漸減少，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)匱乏，菌體生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，甚至死亡，表達(dá)能力下降或喪失，具有表達(dá)活性的菌體總量逐步減少，以致表達(dá)量減少，死亡的菌體釋放蛋白酶，降解胞內(nèi)融合蛋白。

IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)表達(dá)量的影響。IPTG濃度在1.0mmol/L以下時(shí)，其對(duì)載體Lac-Z動(dòng)子的誘導(dǎo)作用尚未飽和，故隨著濃度的升高，誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，蛋白表達(dá)量提高。繼續(xù)提高IPTG濃度時(shí)，因誘導(dǎo)作用飽和，過多的IPTG可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)受影響，表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度等因素對(duì)GST-HST5的表達(dá)也可能存在影響，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

綜上述，Histatin5突變體融合蛋白在大腸桿菌中的優(yōu)化表達(dá)條件為:1mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)6h。

［1］Oppenheim FG，Xu T，McMillian FM，et al.Histatin，a novel family of histidine-rich proteins in human parotid secretion，isolation，characterization，primary structure and fungistatic effects on Candida albicans［J］.Biol Chem，1988，263:7472

［2］劉變芳，郭藹光，金偉波，等.果蠅抗菌肽基因(Andropin)的原核表達(dá)與活性分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，38(7):119