寧 靜，劉莉娜，王 敏，駱健美

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

有機介質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化技術是近年來疏水性化合物生物轉(zhuǎn)化領域的研究熱點.添加有機溶劑增強底物的溶解對于提高生物轉(zhuǎn)化效率具有正向作用，但高濃度有機溶劑對細胞的毒害作用卻成為限制其使用劑量的重要障礙[1–2].研究表明[3–5]，有機溶劑積累在細胞膜上，通過影響膜的理化性質(zhì)，例如，影響細胞膜作為屏障和能量傳導的功能，導致胞內(nèi)大分子的滲透(如RNA、磷脂和蛋白質(zhì))，同時也可能改變細胞膜結(jié)構(gòu)，導致微生物代謝被阻斷，生長受到抑制，甚至導致細胞死亡.

甾體化合物C1，2 脫氫反應是工業(yè)上采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)甾體藥物的典型反應，也是生產(chǎn)氫化潑尼松及其同系物最有價值的反應.其中，簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)以專一性高、反應速率快等優(yōu)點成為工業(yè)生產(chǎn)普遍使用的生產(chǎn)菌株.甾體化合物的全細胞生物轉(zhuǎn)化反應多采用添加有機溶劑的方法促進疏水性底物的溶解[6–7].課題組在前期工作中，考察了4 種有機溶劑(乙醇、DMF、DMSO、甲醇)對簡單節(jié)桿菌TCCC 11037,C1，2 脫氫反應的影響，結(jié)果表明4 種有機溶劑均能提高簡單節(jié)桿菌生物轉(zhuǎn)化醋酸可的松的初始轉(zhuǎn)化速率和最終轉(zhuǎn)化率，其中乙醇的效果最好[8].進一步分析了乙醇對菌體生長和細胞性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙醇濃度的增加，菌體的生長和一些細胞性質(zhì)如跨膜電位和細胞通透性均發(fā)生明顯變化[9].

課題組以簡單節(jié)桿菌TCCC 11037 為出發(fā)菌株，通過紫外誘變結(jié)合高濃度乙醇馴化的方法選育得到1個突變菌株TCCC 11037-UV15X1-2，通過固體平板實驗，確定突變菌株TCCC 11037-UV15X1-2 對乙醇的耐受體積分數(shù)為10%，且具有較好的遺傳穩(wěn)定性.本文以這兩個乙醇耐性差異菌株為對象，分析其在不同乙醇濃度下的生長特性.同時為了降低菌體生長過程的干擾，采用靜息細胞，考察乙醇處理對細胞存活率的影響，并進一步分析了細胞糖代謝能力、細胞膜電位、細胞超顯微結(jié)構(gòu)和通透性的變化.該工作為深入了解簡單節(jié)桿菌在有機溶劑下的細胞性質(zhì)變化，進而探討其耐性機制奠定了一定的理論基礎，為選育耐受高濃度有機溶劑的C1，2 脫氫反應菌株提供科學指導.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

簡單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)出發(fā)菌株TCCC 11037(全文簡稱TCCC 11037)和突變菌株TCCC 11037-UV15X1-2(全文簡稱UV15X1-2)，天津科技大學微生物制藥研究室保存.

斜面/固體平板培養(yǎng)基見參考文獻[10].

菌體培養(yǎng)基(無機鹽培養(yǎng)基)(g/L)：葡萄糖5，KH2PO40.875，K2HPO40.175，(NH4)2SO41，MgSO4·7H2,O 0.5，NaCl 0.1，CaCl2·5H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.04，KI 0.1，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.2，MnCl2·4H2O 0.4，ZnSO40.4，(NH4)2,MoO40.2，pH 7.0～7.2.

1.1.2 主要試劑及儀器

羅丹明 123(Rh123)、二乙酸熒光素(FDA)，Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

JSPM–5200 型原子力顯微鏡，日本日立公司；F–5301PC 型熒光分光光度計，日本島津公司；SBA–90型生物傳感儀，山東省科學院生物研究所.

1.2 方法

1.2.1 菌體生長曲線的繪制

從保存的斜面上挑取 1 環(huán)菌體接種于裝有30,mL 菌體培養(yǎng)基的250,mL 三角瓶中，160,r/min、32,℃進行一級培養(yǎng)，培養(yǎng)36,h 菌體生長進入對數(shù)中后期(此時A600＝1.8)，以10%接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到相同的菌體培養(yǎng)基中，160,r/min、32,℃進行二級培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每間隔一定時間取樣，測定培養(yǎng)液的A600值，以時間(t)為橫坐標，A600為縱坐標，繪制菌體生長曲線.

1.2.2 乙醇條件下菌體的生長特性

分別向上述二級培養(yǎng)到對數(shù)中后期的培養(yǎng)液中加入體積分數(shù)為 2%、6%、10%的乙醇，32,℃、160,r/min 繼續(xù)培養(yǎng)，24,h 和72,h 后分別取樣，測定菌體的A600.

1.2.3 乙醇對細胞的處理過程

收集二級培養(yǎng)到對數(shù)中后期的菌體細胞，用PBS緩沖溶液(pH 7.0)洗滌3 次并重懸，調(diào)節(jié)菌體濃度使A600為1.8，制備成靜息細胞懸浮液.將上述菌體懸浮液分成若干等份，每份25,mL.向每份中加入乙醇，使其終體積分數(shù)為2%、6%、10%，160,r/min、32,℃振蕩處理0.5,h 后，8,000,r/min 離心5,min，收集菌體，用PBS 緩沖溶液洗滌3 次并重懸，進行以下參數(shù)的測定.其中，未經(jīng)乙醇處理的細胞作為對照組.

1.2.4 細胞存活率的測定

采用平板活菌計數(shù)法測定細胞的存活率[9].

1.2.5 糖活力保留值的測定

向離心收集后的菌體細胞中加入10,g/L 葡萄糖水溶液，160,r/min、32,℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4,h 后，取1,mL 樣品，用生物傳感儀測定葡萄糖濃度.糖活力保留值(R)按照式(1)計算.

1.2.6 細胞膜電位測定

采用Rh123 熒光探針法測定細胞膜電位[11]，通過測定對照組的Rh123 熒光強度(I對照Rh123)和乙醇處理后的Rh123 熒光強度(I乙醇Rh123)，按照式(2)計算Rh123 的相對熒光強度.

1.2.7 細胞超顯微結(jié)構(gòu)的觀察

菌體細胞經(jīng)無菌水洗滌2 次，按照文獻[8]的方法制備樣品并觀察.

1.2.8 細胞通透性的測定

采用FDA 熒光探針法[11]測定細胞膜對胞外小分子物質(zhì)FDA 的通透性.通過測定對照組的FDA 熒光強度(I對照FDA)和乙醇處理后的FDA 熒光強度(I乙醇FDA)，按照式(3)計算FDA 的相對熒光強度.

同時，通過測定蛋白質(zhì)和核酸的泄漏量[12]來反映細胞膜對胞內(nèi)大分子物質(zhì)的通透性.

2 結(jié)果與討論

2.1 耐性差異菌株菌體的生長特性

圖1 表示的是兩個菌株在菌體培養(yǎng)基中的生長曲線.由圖1 可知，出發(fā)菌株TCCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的生長規(guī)律基本一致：0～12,h 為延滯期，12～36,h 為對數(shù)期，36,h 之后進入穩(wěn)定期.但兩個菌株的生長速率與A600卻不盡相同，在對數(shù)生長期(12～36,h)，突變菌株UV15X1-2 的生長速率明顯高于出發(fā)菌株TCCCC 11037，分別為0.183,h-1和0.161,h-1.此外，培養(yǎng)72,h 后，突變菌株UV15X1-2和出發(fā)菌株TCCC 11037 的A600均達到了最大值，分別為0.796 和0.675，前者比后者增加了17.9%，說明在不添加乙醇的無機鹽培養(yǎng)基中進行生長，突變菌株UV15X1-2 能夠比出發(fā)菌株TCCC 11037 表現(xiàn)出更好的生長特性.

圖1 出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的生長曲線Fig.1 Growing curves of TCCC 11037 and UV15X1-2

在兩個菌株生長的對數(shù)中后期(36,h)加入不同體積分數(shù)的乙醇(2%、6%、10%)，此時菌體生長趨于穩(wěn)定，細胞的形態(tài)和組成比較一致.繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24,h 和72,h 后取樣測定菌體的A600值，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同乙醇體積分數(shù)下出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2的生長Fig.2 Growth of TCCC 11037 and UV15X1-2 in the presence of different ethanol concentrations

由圖2 可知，當乙醇體積分數(shù)從0%增加到2%時，隨著培養(yǎng)時間的延長，出發(fā)菌株的A600值沒有明顯變化，大概在0.671～0.679 之間波動.而突變菌株UV15X1-2 的A600值均有所增加，其在24,h 和72,h的A600值比出發(fā)菌株對應時間下的A600值分別提高了15.4%和29.4%.之后，出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的生長都隨著乙醇體積分數(shù)的增加受到抑制.但突變菌株UV15X1-2 在不同時間下的A600值均明顯高于對應時間下出發(fā)菌株TCCC 11037 的A600值，且隨著時間的延長，兩者差異的幅度有所增加.尤其在乙醇體積分數(shù)為6%和10%下培養(yǎng)72,h 后，突變菌株UV15X1-2 的A600值比出發(fā)菌株TCCC 11037 分別提高了56.0%和81.7%.

此外，在2%、6%、10%乙醇下，隨著培養(yǎng)時間的延長(24～72,h)，出發(fā)菌株TCCC 11037 的A600值呈下降趨勢，而突變菌株UV15X1-2 的A600值隨著培養(yǎng)時間的延長表現(xiàn)出增加的趨勢，說明突變菌株UV15X1-2 經(jīng)過一段較長時間的適應，表現(xiàn)出繼續(xù)生長的趨勢，突變菌株UV15X1-2 在乙醇壓力下仍具有一定的生長能力.綜合圖1 和圖2 的結(jié)果可知，在乙醇體積分數(shù)0～10%的范圍內(nèi)，突變菌株UV15X1-2比出發(fā)菌株TCCC 11037 表現(xiàn)出更好的生長特性.

2.2 乙醇處理對耐性差異菌株細胞存活的影響

為考察出發(fā)菌株 TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的乙醇耐受能力，分別制備靜息細胞，向其中加入不同體積分數(shù)的乙醇，處理30,min 后觀察細胞的存活情況，結(jié)果如圖3所示.由圖3 可知，當乙醇體積分數(shù)由0%增加到2%時，突變菌株UV15X1-2的存活率為100.0%，沒有變化，而出發(fā)菌株TCCC 11037 的存活率下降為96.4%.當乙醇體積分數(shù)增大到6%時，突變菌株UV15X1-2 的存活率仍保持在95.0%左右，而出發(fā)菌株TCCC 11037 的存活率則快速下降到75.8%.繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)到10%，兩個菌株的存活率均表現(xiàn)出明顯下降的趨勢，其中突變菌株UV15X1-2 的存活率為75.7%，比出發(fā)菌株高出18.3%.由此可見，突變株UV15X1-2 比出發(fā)菌株TCCC 11037 具有更高的乙醇耐受性能.

圖3 乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037和突變菌株UV15X1-2細胞存活的影響Fig.3 Effect of ethanol on the cell survival of TCCC 11037,and UV15X1-2

2.3 乙醇處理對耐性差異菌株糖代謝能力的影響

圖4 表示的是不同體積分數(shù)乙醇處理對耐性差異菌株糖代謝能力的影響.

圖4 乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037和突變菌株UV15X1-2細胞糖代謝能力的影響Fig.4 Effect of ethanol on the sugar metabolic activities of TCCC 11037 and UV15X1-2

從圖4 可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，兩個菌株的細胞糖代謝活力保留值均表現(xiàn)出下降的趨勢.當乙醇體積分數(shù)不超過2%時，出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的細胞糖代謝保留值之間沒有明顯差異，分別為92.0%和93.8%；繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，出發(fā)菌株TCCC 11037 的糖代謝活力保留值表現(xiàn)出更為快速的下降趨勢；當乙醇體積分數(shù)增加到10%時，突變菌株UV15X1-2 的糖代謝活力保留值為77.2%，而出發(fā)菌株TCCC 11037 的糖代謝活力保留值僅為60.6%.由此可見，高濃度乙醇條件下，與突變菌株UV15X1-2 相比，出發(fā)菌株TCCC 11037 的糖代謝能力受到了更為嚴重影響(糖代謝活力保留值下降更明顯)，這種影響直接決定了微生物在有機溶劑壓力下的存活情況.

2.4 乙醇處理對耐性差異菌株細胞膜電位的影響

關于有機溶劑對細胞的毒害作用，目前普遍接受的觀點是有機溶劑在細胞膜上積累，影響細胞膜的基本功能，主要包括細胞膜作為能量傳導(膜電位)和屏障作用(通透性)的功能[13].Rh123 是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，其在正常細胞中能夠依賴跨膜電位進入細胞基質(zhì)，能特異地吸附于細胞內(nèi)膜上和細胞質(zhì)中，發(fā)出黃綠色熒光；而當細胞膜完整性被破壞時，細胞膜通透性增大，引起線粒體跨膜電位崩潰，Rh123 重新釋放出細胞，熒光強度會下降[11].圖5 表示的是乙醇處理對菌體細胞膜電位的影響.

圖5 乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037和突變菌株UV15X1-2細胞膜電位的影響Fig.5 Effect of ethanol on the membrane potential of TCCC 11037 and UV15X1-2

由圖5 可以看到，當乙醇體積分數(shù)從0%增大到10%，兩個菌株的Rh123 相對熒光強度均不斷減少，即兩個菌株的細胞膜電位隨著乙醇體積分數(shù)的增加均表現(xiàn)出不斷下降的趨勢.當乙醇體積分數(shù)為10%時，出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2 的細胞膜電位最低，分別為64.4%和72.4%.同時，在不同的乙醇體積分數(shù)下，突變菌株UV15X1-2 的細胞膜電位均高于出發(fā)菌株TCCC 11037.結(jié)合圖4 的實驗結(jié)果可知，乙醇的加入影響了細胞的代謝能力和細胞膜作為能量傳導的功能.與突變菌株UV15X1-2 相比，高濃度乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037 的影響更為明顯，這可能是兩個菌株在乙醇壓力下細胞存活情況產(chǎn)生差異的重要原因.

2.5 乙醇處理對耐性差異菌株細胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響

文獻[14]報道，有機溶劑能夠插入細胞膜脂雙分子層，使細胞的結(jié)構(gòu)受到影響.因此，通過原子力顯微鏡對兩個菌株在不同乙醇體積分數(shù)下的超顯微結(jié)構(gòu)進行觀察，結(jié)果如圖6 所示.

圖6 不同乙醇體積分數(shù)下出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2的超顯微結(jié)構(gòu)Fig.6 AFM images of TCCC 11037 and UV15X1-2 in the presence of different ethanol concentrations

由圖6 可知：對于出發(fā)菌株TCCC 11037，在沒有乙醇的條件下，細胞形態(tài)較規(guī)則，近似短桿狀，細胞表面光滑，結(jié)構(gòu)完整；隨著乙醇濃度的增加，形態(tài)逐漸變得不規(guī)則，細胞表面開始有凹陷，表面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損.當乙醇體積分數(shù)為6%時，細胞的超顯微結(jié)構(gòu)觀察到較為明顯的破壞，觀察到有胞漿流出(見圖6(a)箭頭所示)；當乙醇體積分數(shù)增加至10%時，細胞表面變得不平整，胞漿大量流出，細胞完整性遭到破壞，這時細胞的存活率、糖代謝能力、細胞膜電位分別下降了 24.2%、28.1%、16.5%.對于突變菌株UV15X1-2，在沒有乙醇的條件下，細胞形態(tài)與出發(fā)菌株TCCC 11037 相同.當乙醇體積分數(shù)為6%時，菌體表面仍較為平整，保持良好的完整性；當乙醇體積分數(shù)為10%時，觀察到菌體細胞內(nèi)有少量胞漿流出(見圖6(b)箭頭所示)，這與該條件下觀察到的細胞存活率和各種生理特性開始下降的結(jié)果是一致的.

2.6 乙醇處理對耐性差異菌株細胞通透性的影響

簡單節(jié)桿菌作為C1，2 脫氫反應菌株，其細胞通透性是一個重要的生理特性.這一方面是因為細胞通透性影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收或其他物質(zhì)(代謝產(chǎn)物、離子、酶等)的跨細胞轉(zhuǎn)運，對微生物在有機溶劑壓力條件下的生長與存活至關重要[15].更重要的是，細胞通透性對于疏水性底物的跨膜擴散以及產(chǎn)物的排出具有重要意義，將直接影響轉(zhuǎn)化反應的效率[16].

簡單節(jié)桿菌C1，2 脫氫反應的底物——醋酸可的松屬于疏水性的小分子化合物，其進入細胞的方式屬于自由擴散，對于物質(zhì)自由擴散進入細胞的難易程度，細胞膜的通透特性是一個非常關鍵的因素.因此，本文通過測定兩個菌株對疏水性化合物二乙酸熒光素FDA 的通透性和細胞內(nèi)大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)和核酸)的泄漏量對細胞的通透性進行綜合表征.

FDA 是一種不帶電荷、物理特性與甾體類化合物相類似的親脂性分子.其進入細胞后可被胞內(nèi)酯酶水解得到熒光素而被截留在細胞內(nèi)，F(xiàn)DA 熒光強度增大，表明細胞損傷，通透性增加，但細胞又未死亡[11].不同乙醇體積分數(shù)處理對菌體細胞FDA 通透性的影響如圖7 所示.

圖7 不同乙醇體積分數(shù)下出發(fā)菌株TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2的FDA相對熒光強度Fig.7 Effect of ethanol on the FDA relative fluorescence intensity of TCCC 11037 and UV15X1-2

由圖7 可知：當乙醇體積分數(shù)由0%增加到2%時，兩個菌株的FDA 相對熒光強度基本相同，且表現(xiàn)為增加的趨勢，說明經(jīng)過該體積分數(shù)的乙醇處理能增加細胞對疏水性小分子物質(zhì)的通透性.繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，突變菌株UV15X1-2 的FDA 相對熒光強度繼續(xù)增大，在乙醇體積分數(shù)為6%時達到最高，為112.3%.之后，繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)到10%時，F(xiàn)DA 相對熒光強度下降為90.7%，分析可能原因是高濃度乙醇抑制了胞內(nèi)酯酶的活性，這一現(xiàn)象與文獻報道的結(jié)論一致[17].對于出發(fā)菌株TCCC 11037，乙醇體積分數(shù)從2%增加到10%時，細胞的FDA 相對熒光強度不斷下降，當乙醇體積分數(shù)為10%時，F(xiàn)DA相對熒光強度為78.9%.

圖8 表示的是經(jīng)過乙醇處理細胞蛋白質(zhì)和核酸泄露的變化.由圖8 可知：當乙醇體積分數(shù)為2%時，兩個菌株細胞內(nèi)大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、核酸)沒有觀察到明顯泄露.繼續(xù)增大乙醇濃度，兩個菌株的蛋白質(zhì)和核酸泄漏量明顯增加.與突變菌株UV15X1-2 相比，出發(fā)菌株TCCC 11037 表現(xiàn)出更為明顯的蛋白質(zhì)和核酸的泄露.

圖8 乙醇處理對出發(fā)菌株 TCCC 11037 和突變菌株UV15X1-2細胞蛋白質(zhì)和核酸泄漏的影響Fig.8 Effect of ethanol on the protein and nucleic acid leakage of TCCC 11037 and UV15X1-2

由圖7 和圖8 可知，乙醇處理能夠提高細胞的通透性.但這種通透性對于疏水性化合物生物轉(zhuǎn)化反應能否產(chǎn)生影響還有待于進一步研究，目前已有很多通過增強細胞通透性提高甾體生物轉(zhuǎn)化效率的報道.Korycka-Machala 等[18]研究表明，聚陽離子(例如魚精蛋白、聚乙烯亞胺)通過增加分枝桿菌細胞壁對疏水性化合物的滲透，β–谷甾醇的轉(zhuǎn)化率提高了3倍；Avramova 等[19]通過制備靜息細胞，研究了表面活性劑Tween 80 對Rhodococcus sp.細胞的9,α–羥基化反應的影響，結(jié)果表明：采用Tween 80 處理細胞30,min，可有效提高雄甾–4–烯–3，17–二酮(AD)的轉(zhuǎn)化效率.

3 結(jié)論

(1)突變菌株 UV15X1-2 與出發(fā)菌株 TCCC 11037 相比，在添加了0%～10%體積分數(shù)乙醇的菌體培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出更好的生長特性.

(2)通過制備靜息細胞，確定了0%～10%體積分數(shù)的乙醇對細胞存活率的影響.結(jié)果表明，突變菌株UV15X1-2 比出發(fā)菌株TCCC 11037 表現(xiàn)出更好的乙醇耐受性.在6%體積分數(shù)乙醇下，出發(fā)菌株TCCC 11037 的糖代謝能力和細胞膜電位明顯下降，細胞完整性遭到嚴重破壞；而突變菌株UV15X1-2 在乙醇體積分數(shù)為10%時才發(fā)生糖代謝活力和細胞膜電位下降，細胞完整性破壞的現(xiàn)象.這些細胞生理特性的變化與菌體細胞的存活息息相關.

(3)通過測定胞外物質(zhì)FDA 向細胞內(nèi)的擴散和胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸向細胞外的泄漏，考察了乙醇處理對細胞通透性的影響.結(jié)果表明，與突變菌株UV15X1-2 相比，乙醇對出發(fā)菌株TCCC 11037 細胞通透性的影響更加明顯，這可能也是該菌株在高濃度乙醇處理下細胞存活率明顯下降的重要原因.

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