林浩，林偉鋒，陳中

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

亞硝酸鹽是公認(rèn)的一種強(qiáng)致癌物質(zhì)［1－2］。如何控制并降低泡菜中的亞硝酸鹽含量成為食品安全領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌降解亞硝酸鹽方面多有研究。張慶芳［3］等人認(rèn)為，乳酸菌降解亞硝酸鹽分為兩部分，在pH ＞4.5 的發(fā)酵前期主要以酶降解為主;在pH ＜4.0 的發(fā)酵后期，主要以酸降解為主。Doods 和Kim［4－6］等人也報(bào)道了植物乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、綠色乳桿菌、泡菜乳桿菌等乳酸菌都有降解亞硝酸鹽的能力。Yan［7］等人從泡菜中分離到6 株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)其在MRS 液體培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽的能力都較好。

本文選用兩種常用的泡菜生產(chǎn)人工接種劑:植物乳桿菌和腸膜明串珠菌，分別接種到液體MRS 培養(yǎng)液中，測(cè)定在發(fā)酵過(guò)程中pH、總酸、活菌數(shù)及亞硝酸鹽含量變化，并分析各指標(biāo)間的相關(guān)性。試圖通過(guò)不同指標(biāo)對(duì)亞硝酸鹽降解率的影響來(lái)確定乳酸菌降解亞硝酸鹽的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:植物乳桿菌LP-L134-1-P(簡(jiǎn)稱LP)、腸膜明串珠菌LM-L134-1-P(簡(jiǎn)稱LM)，均來(lái)源于華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

MRS 固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、牛肉膏8 g、酵母膏4 g、吐溫－80 1 g、K2HPO42 g、檸檬酸氫二銨2 g、乙酸鈉5 g、MgSO40.2 g、MnSO40.04 g、瓊脂15 g，加去離子水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH6.2 ±0.2

MRS 液體培養(yǎng)基:不加瓊脂，其他成分同MRS固體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-25 數(shù)顯pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱;電子秤;手提式高壓滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);水浴恒溫振蕩器，金壇市宏華儀器廠;超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單菌接種降解亞硝酸鹽能力

配制好4 瓶液體MRS 培養(yǎng)液并高溫滅菌，靜置放涼后加入NaNO2(NaNO2首先在硅膠干燥器中干燥24h，然后紫外燈照射30 min 滅菌)，使其濃度均為150 mg/kg。將兩種乳酸菌(LP、LM)菌粉按菌體濃度為106CFU/mL 接種到培養(yǎng)液中，37 ℃下培養(yǎng)72 h。每隔12 h 檢測(cè)培養(yǎng)液的pH 值、總酸度、活菌數(shù)及亞硝酸鹽含量。

2 株乳酸菌降解亞硝酸鹽能力以亞硝酸鹽降解率來(lái)表示。

亞硝酸鹽降解率/% =( 亞硝酸鹽初始含量－降解后的亞硝酸鹽含量) /亞硝酸鹽初始含量×100

1.3.2 去離子水中直接添加乳酸降解亞硝酸鹽

取去離子水添加NaNO2至其濃度為100 mg/L，分別添加乳酸至溶液pH 分別為6、5、4、3，并設(shè)置空白對(duì)照。所有處理在500 mL 錐形瓶中進(jìn)行，裝液量為250 mL，用透氣紗布封口，實(shí)驗(yàn)期間將錐形瓶置于37 ℃恒溫箱靜置，定時(shí)檢測(cè)溶液中亞硝酸鹽濃度的變化。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 pH 的測(cè)定

PHS-25 型酸度計(jì)。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值。

1.4.2 總酸度的測(cè)定

培養(yǎng)液中的酸性物質(zhì)主要成分是乳酸等有機(jī)酸，用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以PHS-25 型酸度計(jì)測(cè)定，終點(diǎn)8.2，結(jié)果以乳酸表示。

1.4.3 活菌數(shù)的測(cè)定

活菌數(shù)測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法。

1.4.4 亞硝酸鹽測(cè)定

采用GB/T5009.33 －2003 方法中鹽酸萘乙二胺分光光度計(jì)比色法，樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 活菌數(shù)和亞硝酸鹽降解率的變化值及規(guī)律

考察了在培養(yǎng)溫度37 ℃、接種量106CFU/mL的條件下LP 和LM 在NaNO2濃度為150 mg/kg 的MRS 液體培養(yǎng)液中發(fā)酵72 h 內(nèi)活菌數(shù)、亞硝酸鹽降解率的變化，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 培養(yǎng)液中活菌數(shù)與亞硝酸鹽降解率變化值Fig 1 Changes of samples in viable cell numbers and nitrite degradation rate during fermentation

從圖1 中可以看出，2 株乳酸菌在液體MRS 培養(yǎng)液中均能較好的生長(zhǎng)。從進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)看，LM 需要的時(shí)間更短，增長(zhǎng)速率也更快。LM 在培養(yǎng)12 h 后細(xì)菌總數(shù)可由剛接種時(shí)的1.6 × 106CFU/mL 達(dá)到菌體最高生長(zhǎng)濃度1.49 × 108CFU/mL。從能夠得到的最高菌體濃度來(lái)看，LP 能達(dá)到1.97 ×109CFU/mL，活菌數(shù)遠(yuǎn)高于LM。2 株菌都在培養(yǎng)36 h 后開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，之后活菌數(shù)急劇下降。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量都在減少，但LP 在降解速率、能力上明顯要優(yōu)于LM。培養(yǎng)12 h 后，LP 和LM 對(duì)亞硝酸鹽的降解率分別只有15.36%及18.47%。結(jié)合其生長(zhǎng)曲線來(lái)看，在培養(yǎng)的前12 h 兩種乳酸菌正處于遲滯期和對(duì)數(shù)期前期，細(xì)菌生長(zhǎng)活動(dòng)不旺盛，對(duì)亞硝酸鹽的降解率偏低。而從12 h 開(kāi)始，LP 對(duì)亞硝酸鹽的降解率開(kāi)始快速增長(zhǎng)，到36 h 降解率已經(jīng)達(dá)到96.25%，對(duì)亞硝酸鹽的降解基本已達(dá)到頂峰?？赡苁窃谶@段時(shí)間內(nèi)LP 處于生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，細(xì)菌代謝旺盛，細(xì)胞分泌亞硝酸鹽還原酶量、產(chǎn)酸量增多，從而達(dá)到分解破壞亞硝酸鹽的效果。與LP 相比，LM 降解亞硝酸鹽能力很弱，在培養(yǎng)的72 h 內(nèi)對(duì)亞硝酸鹽的降解率呈緩慢上升趨勢(shì)，72 h 后降解率才達(dá)到最高，僅為38.77%。

2.2 pH 和亞硝酸鹽降解率變化值及規(guī)律

由圖2 可以看出，LP、LM 在發(fā)酵過(guò)程中pH 變化趨勢(shì)區(qū)別明顯。LM 在發(fā)酵的72 h 內(nèi)pH 變化幅度不大，僅由6.2 下降至5.35。結(jié)果表明LM 產(chǎn)酸能力很弱，pH 的變化與其所處的生長(zhǎng)周期并沒(méi)有很大的聯(lián)系。LP 在培養(yǎng)的72 h 內(nèi)pH 由6.22 降至3.87，下降幅度很大。其中，在培養(yǎng)的前12 h 內(nèi)pH 變化幅度較小。在12 ～36 h 內(nèi)LP 的pH 下降速度很快，之后變化幅度漸趨緩和，這與其活菌數(shù)變化曲線結(jié)果是相一致的。LP 在前12 h 內(nèi)是處于遲滯期，乳酸菌發(fā)酵增長(zhǎng)緩慢。在12 ～36 h 內(nèi)LP 處于對(duì)數(shù)期，乳酸菌開(kāi)始快速產(chǎn)酸，故pH 變化很快。之后LP 處于穩(wěn)定期、衰亡期，隨著生長(zhǎng)環(huán)境中酸度的持續(xù)積累，高濃度的酸開(kāi)始對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)起抑制作用，活菌數(shù)隨之下降。綜合2 株乳酸菌亞硝酸鹽降解率曲線來(lái)看，pH 的降低能夠有效促進(jìn)乳酸菌降解亞硝酸鹽。從降解效果來(lái)看，pH 在大于5.60 時(shí)，LM 對(duì)亞硝酸鹽的降解較少，只有30%左右。而LP 培養(yǎng)液中pH 開(kāi)始降至4 或以下時(shí)，亞硝酸鹽含量下降迅速，降解率可達(dá)到80%以上，這與張慶芳［3］等人的研究結(jié)果一致。

2.3 總酸和亞硝酸鹽降解率變化值及規(guī)律

從圖3 可以看出，2 株菌在培養(yǎng)過(guò)程中的總酸與亞硝酸鹽降解率變化趨勢(shì)基本一致。LM 產(chǎn)酸能力很弱，在發(fā)酵的72 h 內(nèi)總酸由0.23%升至0.34%，上升趨勢(shì)緩慢。與之對(duì)應(yīng)的是其對(duì)亞硝酸鹽的降解率，發(fā)酵72 h 后降解率僅達(dá)到38.77%。LP 產(chǎn)酸迅速，在培養(yǎng)的72 h 內(nèi)總酸由0.20%升至1.80%。在培養(yǎng)的12 ～36 h 內(nèi)，LP 處于對(duì)數(shù)期，酸度上升極快，由0.35%上升到1.492%。這段時(shí)間內(nèi)LP 對(duì)亞硝酸鹽的降解速率也由15.36%上升到96.25%，與總酸的上升趨勢(shì)極為吻合。

圖2 培養(yǎng)液中pH 與亞硝酸鹽降解率變化值Fig 2 Changes of samples in pH and nitrite degradation rate during fermentation

圖3 培養(yǎng)液中總酸與亞硝酸鹽降解率變化值Fig 3 Changes of samples in total acid and nitrite degradation rate during fermentation

2.4 各指標(biāo)之間相關(guān)性分析

用SPSS 軟件對(duì)培養(yǎng)液中pH、總酸、活菌數(shù)和亞硝酸鹽降解率簡(jiǎn)單相關(guān)性如表1 所示。由表1 可知，在接入LM、LP 的培養(yǎng)液中，pH 與亞硝酸鹽降解率之間的Pearson Correlation 分別為－0.974 和－0.985，|r|均大于0.8，可見(jiàn)培養(yǎng)液中的pH 與亞硝酸鹽降解率之間呈高度負(fù)相關(guān)。同樣地，兩種培養(yǎng)液中總酸含量與亞硝酸鹽降解率之間的Pearson Correlation 分別為0.989、0.998，呈高度的正相關(guān)。這表明pH 越小、總酸越高，亞硝酸鹽降解率越高。這主要是因?yàn)槿樗峋谂囵B(yǎng)過(guò)程中不斷產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵液中H+濃度的升高(即pH 的降低和總酸的升高)。較高的酸度可以分解破壞亞硝酸鹽，從而使亞硝酸鹽降解率升高。而LM、LP 培養(yǎng)液中的活菌數(shù)與亞硝酸鹽降解率之間的Pearson 相關(guān)性僅為－0.067、0.273，|r| ＜0.3，可認(rèn)為兩者之間不相關(guān)?；罹鷶?shù)數(shù)量的多少反應(yīng)了乳酸菌所分泌的亞硝酸鹽還原酶量的多少，由此說(shuō)明LM、LP 對(duì)亞硝酸鹽的酶降解所起作用并不明顯，起主要作用的是酸降解。另外，相較于pH 對(duì)亞硝酸鹽降解率的影響，總酸與亞硝酸鹽降解率之間相關(guān)性更為顯著。說(shuō)明乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的酸降解除了游離的H+對(duì)亞硝酸鹽的分解破壞，乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中分泌的乳酸等有機(jī)酸也有促進(jìn)作用。乳酸單獨(dú)對(duì)亞硝酸鹽的清除作用需要在下一步實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行印證。

表1 培養(yǎng)液中pH、總酸、活菌數(shù)與亞硝酸鹽降解率之間相關(guān)性Table 1 Correlation analysis between pH，total acid，viable cell numbers and nitrite degradation rate

2.5 直接添加乳酸對(duì)降解亞硝酸鹽的影響

從圖4 可以看出，往去離子水中添加乳酸后，隨著時(shí)間的推移亞硝酸鹽含量都出現(xiàn)不同程度的下降，而對(duì)照組亞硝酸鹽含量基本不變。添加的乳酸濃度越多，即溶液初始pH 值越低，亞硝酸鹽含量下降的趨勢(shì)越明顯，原因是乳酸可以通過(guò)與亞硝酸鹽發(fā)生歧化反應(yīng)2H++3NO2－ = NO3+2NO↑+ H2O 去除亞硝酸鹽。當(dāng)添加乳酸調(diào)節(jié)溶液初始pH 值在5 以上時(shí)，亞硝酸鹽的降解率在24 h 內(nèi)不足20%，降解效果不顯著。當(dāng)添加乳酸至溶液初始pH 為4 或以下時(shí)，亞硝酸鹽含量下降明顯，其中初始pH 為3 時(shí)，亞硝酸鹽含量下降速率很快，在第10 h 的時(shí)候降解率即可達(dá)到81.98%。這與之前LP 培養(yǎng)液在pH 下降到4 以后對(duì)亞硝酸鹽的降解率急劇增加的結(jié)果是一致的。綜合LP、LM 兩株菌降解亞硝酸鹽的結(jié)果，進(jìn)一步印證了乳酸菌降解亞硝酸鹽主要是依靠酸降解。

從圖5 可以看出:培養(yǎng)液初始pH 越低，總酸含量也越低，添加乳酸的培養(yǎng)液在24 h 內(nèi)總酸含量變化并不明顯，可能是因?yàn)閬喯跛猁}含量比較少所以消耗的乳酸量也較少的緣故。初始pH 為3 的培養(yǎng)液中總酸含量在1.06%左右，初始pH 為4、5、6 的去離子水中總酸含量均低于0.2%。結(jié)合前面的數(shù)據(jù)可以推斷出:培養(yǎng)液中pH 降至3 以下、總酸升至1.06%以上時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的降解效果明顯。

圖4 添加乳酸后去離子水中亞硝酸鹽降解率的變化Fig 4 Variation trend of nitrite degradation rate in deionized water after adding lactic acid

圖5 添加乳酸后去離子水中總酸含量的變化Fig 5 Variation trend of total acid in deionized water after adding lactic acid

3 結(jié)論

(1)在提供充足營(yíng)養(yǎng)的情況下，LM、LP 兩株乳酸菌都有降解亞硝酸鹽的能力，從亞硝酸鹽降解速率和降解量來(lái)看，LP 對(duì)亞硝酸鹽的去除效果要好于LM。

(2)在培養(yǎng)的前12 h 內(nèi)，乳酸菌處于遲滯期，培養(yǎng)液中的pH 偏高、總酸度偏低，乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解可能主要依靠乳酸菌分泌的亞硝酸鹽還原酶，但酶降解效果并不十分顯著。

(3)2 株乳酸菌培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽降解率與pH 值呈顯著的負(fù)相關(guān)，與總酸度呈顯著的正相關(guān)，與活菌數(shù)的變化并無(wú)明顯關(guān)系。說(shuō)明乳酸菌降解亞硝酸鹽主要的影響因素是發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸，pH 越小、總酸越高，亞硝酸鹽降解率越高。

(4)相較于pH 對(duì)亞硝酸鹽降解率的影響，總酸與亞硝酸鹽降解率之間相關(guān)性更為顯著。說(shuō)明乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解除了培養(yǎng)液中游離的H+對(duì)亞硝酸鹽的分解破壞，乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中分泌的乳酸等有機(jī)酸也有促進(jìn)作用。

(5)往去離子水中添加更高濃度的乳酸，降解亞硝酸鹽效果也越顯著。當(dāng)初始溶液pH 值調(diào)節(jié)至3(總酸為1.04%左右)時(shí)，在10 h 后降解率即可達(dá)到81.98%，進(jìn)一步驗(yàn)證了乳酸菌降解亞硝酸鹽主要依靠酸降解。

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