齊建紅，趙詠梅，方剛，李丹，王改改

(西安文理學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，陜西西安，710065)

野鳶尾(Iris dichotoma)為鳶尾科鳶尾屬植物，又名白射干、射干鳶尾，根莖或全草入藥，具有清熱解毒、止痛等功效。廣泛分布于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、陜西等地，生于沙質(zhì)草地、山坡、丘陵等處［1］。常用于咽喉腫痛、胃痛、肝炎、乳腺炎、牙齦腫痛等治療［2］。迄今為止，從野鳶尾中已經(jīng)分離得到了30多個化合物［3］，主要為黃酮類化合物［4］。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，它的生理活性較為廣泛，具有抗氧化抗衰老、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、治療腦血管病及降血脂等功能［5］。本文對野鳶尾中主要的活性成分——總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，以便更好地開發(fā)和利用野鳶尾。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野鳶尾(采自陜西秦嶺紅河谷，經(jīng)張九東老師鑒定為野鳶尾)，蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院)，硝酸鋁，亞硝酸鈉，無水乙醇等均為分析純。

UV－2450紫外分光光度計(日本島津公司)，JY92－2D超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，F(xiàn)Z102型微型植物試樣粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，萬分之一天平(德國賽多利斯)。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測波長的選擇

精密量取0.15 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇5 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO20.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)30.3 mL，搖勻，放置6 min;最后加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，以空白試劑做對照，用紫外分光光度計在波長450～550的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長。

1.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取野鳶尾粉末1.0 g于燒杯中。加入一定量60%的乙醇在一定溫度下200 W超聲一定時間趁熱減壓抽濾得上清液即可。

1.2.3 對照品溶液的制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［6］

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，于小燒杯中，用60%乙醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中定容，搖勻，即得0.15 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mL分別置于10 mL容量瓶中;加入60%乙醇至5 mL;加入5%NaNO20.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min。最后加入1 mol/LNaOH溶液2 mL。用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，放置15 min后在波長510 nm處測定吸光度，，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定以乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、料液比(D)4個試驗因素進(jìn)行正交設(shè)計，每因素3個水平(表1)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗，優(yōu)化野鳶尾總黃酮的提取工藝。

1.2.5 樣品分析

對正交試驗溶液按1.2.3項下方法進(jìn)行顯色，紫外分光光度計測定吸光度，計算樣品中總黃酮得率。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

從圖1可以看出，蘆丁在波長450～504 nm時吸光度不斷增大，當(dāng)波長超過504 nm之后，吸光度呈下降趨勢，因此確定測定波長為504 nm。

圖1 檢測波長的掃描Fig.1 The scanning figure of detecting wavelength

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過測定不同濃度的蘆丁對照品溶液吸光度值，以濃度(mg/mL)對吸光度值進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為Y=12.674X+0.0044，R2=0.999 4。結(jié)果表明蘆丁含量在0.0～0.75 mg/mL與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖2所示。

圖2 方法-標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Methed－standard curves

2.3 方法學(xué)考察［7］

2.3.1 精密度試驗

精密吸取蘆丁對照品溶液3.00 mL于10 mL容量瓶中，加60% 乙醇5 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min;加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁對照品為空白，在504 nm處測定吸光度，連續(xù)6次，平均吸光度為0.582，計算得RSD為1.04%，精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

精密吸取1份野鳶尾供試品溶液3 mL，按照1.2.3 項中的方法顯色，分別于間隔0、10、20、30、40、50、60 min，在504 nm波長處測定吸光度。結(jié)果顯示，1 h內(nèi)吸光度值無明顯變化，計算得RSD 1.22%，供試品溶液顯色后在1 h內(nèi)穩(wěn)定。所得總黃酮穩(wěn)定性好，適宜于生產(chǎn)應(yīng)用。

2.3.3 重復(fù)性試驗

按照野鳶尾供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液(相同藥材重量)，然后分別按照1.2.3項中的方法顯色進(jìn)行測定，計算野鳶尾總黃酮得率，RSD 1.42%，此方法重復(fù)性良好。

2.4 正交試驗優(yōu)選總黃酮提取工藝

從表2數(shù)據(jù)分析可知，乙醇濃度、提取時間、提取溫度、固液比4個因素對野鳶尾總黃酮提取的影響主次順序為:提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時間。實驗的最優(yōu)因素水平組合為A2B2C3D1，即，乙醇濃度為80%，提取時間為5 min，提取溫度為90℃，料液比1∶20。野鳶尾總黃酮的得率為4.007 mg/g。

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Results of L9(34)orthogonal test

2.5 實驗因素對總黃酮提取量影響的方差分析

從方差分析結(jié)果(見表3)可知，乙醇濃度和提取溫度2個因素對總黃酮提取率都有顯著影響，液料比和提取時間的影響不顯著。提取溫度對總黃酮提取率影響最大，乙醇濃度對總黃酮提取率影響較大，其次，料液比對總黃酮的提取有一定影響，4個因素中，以提取時間影響最小。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis for the orthogonal array design experimental results

3 結(jié)論

野鳶尾可以作為觀賞植物，又具有一定的藥用價值，本實驗首次對野鳶尾總黃酮進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化研究，結(jié)果表明，影響野鳶尾總黃酮的最佳提取工藝因素為提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時間，最佳提取工藝條件為A2B2C3D1。即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比1∶20(g∶mL)，提取時間為 5 min，提取溫度為90℃，此條件下總黃酮為4.007 mg/g。為野鳶尾中黃酮成分在食品藥品領(lǐng)域的開發(fā)利用研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

［1］趙毓棠.中國植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1985，16(1):134.

［2］王冰，徐巖，鄭太坤，等.射干鳶尾的核型分析［J］.中國藥學(xué)雜志，1998，33(12):716－719.

［3］齊建紅，翟永功，趙長琦.鳶尾屬植物的化學(xué)成分及其生物活性［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(1):165－170.

［4］齊建紅.野鳶尾植物的生物學(xué)特征及化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，(2):121－123.

［5］曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展［J］.西北植物學(xué)報2003，23(12):2241－2247.

［6］扶慶權(quán)，徐鑒.正交試驗法優(yōu)化草莓中總黃酮的提取工藝研究［J］.中國食品添加劑，2011(6):130－135.

［7］陶阿麗，戴一，華芳.桂花中總黃酮提取工藝及采收期研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(2):247－249.