楊玉花 ，魏曉莉 ，鄭建全

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 毒物藥物研究所，北京 100850；2.中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京 100094

脂氧化酶（lipoxygenase，LOX）是哺乳細(xì)胞內(nèi)參與花生四烯酸代謝通路的重要酶類，可催化氧分子添加至花生四烯酸和多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生氫過氧化衍生物，進(jìn)一步生成各類花生酸物質(zhì)[1]。15-LOX催化氧分子插入其底物的C13或15位，存在2種亞型，即15-LOX-1和15-LOX-2。脂氧化酶代謝通路廣泛參與人體代謝調(diào)節(jié)，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化和衰老，特別是在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，靶向脂氧化酶的抗癌作用研究已成為熱點(diǎn)。15-LOX-2在許多腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失，可能作為抑癌基因參與細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)[2-3]。在抗癌作用研究中，須將15-LOX-2基因過表達(dá)或抑表達(dá)，但以往的研究都不具備時(shí)空可控性，從而在解決腫瘤問題時(shí)，給15-LOX-2的功能研究帶來了一定的困難。

Gossen等[4-5]建立的四環(huán)素基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)（Tet-On/Tet-Off系統(tǒng)）高效無毒、具有嚴(yán)密的開/關(guān)功能。其中，Tet-On系統(tǒng)為四環(huán)素正向調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)，是一種可誘導(dǎo)性的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，當(dāng)有四環(huán)素的衍生物強(qiáng)力霉素（doxycline，DOX）存在時(shí)，可誘導(dǎo)插入啟動(dòng)子下游的目的基因高效表達(dá)，而撤走藥物時(shí)基因一般不被轉(zhuǎn)錄[6]。對(duì)于15-LOX-2基因表達(dá)調(diào)控的研究，該系統(tǒng)顯得十分便利。

肺癌是世界上癌癥死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和致亡率居各種惡性腫瘤之首[3，7]，而其傳統(tǒng)治療方式只能提供有限的成功。因此，改進(jìn)肺癌治療效果的相關(guān)研究是非常急迫和至關(guān)重要的。為此，我們選用人肺癌細(xì)胞株A549，采用Tet-On Ad?vanced系統(tǒng)的pTRE-Tight載體，構(gòu)建了時(shí)空表達(dá)可控的pTRE-Tight-15-LOX-2表達(dá)載體，為深入研究脂氧化酶信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

肺腺癌細(xì)胞A549由本研究所四室惠贈(zèng)；感受態(tài)大腸桿菌TOP10、DNA marker購自北京博邁德生物公司；15-LOX-2載體質(zhì)粒pcDNA3-15-LOX-2由海德堡德國癌癥研究中心Peter Krieg博士惠贈(zèng)；Tet-On Advanced Inducible Gene Expression Sys?tems（pTet-On-Advanced、pTRE-Tight、pTRE-Tight-Luc）購自Clontech公司；限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、SalⅠ、BamHⅠ）、DNA連接試劑盒購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒、Luciferase Assay System為Promega公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒購自北京蓋寧金諾生物公司；Lipo?fectAMINE 2000購自Invitrogen公司；兔抗15-LOX-2抗體購自Cayman公司；小鼠抗β-Actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔抗體、HRP標(biāo)記的抗鼠抗體購自中山金橋公司；Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自天根生化公司。

1.2 線性化15-LOX-2 cDNA的制備

將質(zhì)粒pcDNA3-15-LOX-2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，擴(kuò)增含質(zhì)粒細(xì)菌，用質(zhì)粒小提試劑盒提取15-LOX-2 cDNA，用內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ對(duì)15-LOX-2 cDNA進(jìn)行雙酶切，電泳驗(yàn)證片段大小。

1.3 pTRE-Tight-15-LOX-2的構(gòu)建

將質(zhì)粒pTRE-Tight用內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切，電泳驗(yàn)證片段大小，用瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒將pcDNA3-15-LOX-2和pTRETight雙酶切電泳驗(yàn)證產(chǎn)物切膠回收后，用DNA連接試劑盒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRE-Tight-15-LOX-2，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌后，挑單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

1.5.1 pTet-On-Advanced、pTRE-Tight-Luc共轉(zhuǎn)染載體比例篩選 分3個(gè)比例組，即1∶1、1∶5和5∶1，每個(gè)比例含2組細(xì)胞，一組不加DOX作為對(duì)照，另一組加入DOX誘導(dǎo)螢光素酶表達(dá)。

1.5.2 pTet-On-Advanced與pTRE-Tight-15-Lox-2共轉(zhuǎn)染 分3組，即空白對(duì)照組、添加DOX組和不加DOX組。

1.6 LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染及DOX誘導(dǎo)

經(jīng)過24 h培養(yǎng)，將A549細(xì)胞培養(yǎng)至90%～95%的融合度時(shí)，按LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染說明書，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中去，轉(zhuǎn)染5 h后加入DOX誘導(dǎo)，24 h后檢測。

1.7 螢光素酶活性檢測

按Luciferase Assay System說明書的方法，吸掉培養(yǎng)基，用PBS洗96孔板中待分析的細(xì)胞2次，完全吸走PBS，每孔加入25 μL 1×PLB，放搖床上室溫輕搖 15～30 min，收集細(xì)胞裂解液，每個(gè)樣品取 10 μL蛋白裂解液，加入50 μL Luciferase Assay Reagent，用螢光素酶檢測儀檢測螢光素酶活力，計(jì)算誘導(dǎo)倍數(shù)（誘導(dǎo)倍數(shù)=加DOX組活力/不加DOX組活力）。

1.8 Western印跡檢測A549細(xì)胞中15-LOX-2的表達(dá)

經(jīng)DOX誘導(dǎo)24 h后，收集細(xì)胞于1.5 mL EP管，加入0.1 mL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液［50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150mmol/L NaCl，1% NP40，0.1%SDS，0.5%脫氧膽酸鈉，臨用前加入蛋白酶抑制劑混合物］，于冰上裂解30 min，40℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA Protein Assay試劑盒定量。取40 μg蛋白加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min后進(jìn)行SDS-PAGE分離（分離膠濃度為8%），轉(zhuǎn)PVDF膜后用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉l h，加稀釋的一抗抗體（1∶1500）雜交（4℃過夜），PBST洗膜后加入HRP偶聯(lián)的二抗作用50 min，暗室內(nèi)加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑，X線膠片顯影。

2 結(jié)果

2.1 pTRE-Tight-15-Lox-2載體的構(gòu)建

pcDNA3-15-LOX-2和pTRE-Tight載體分別用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在2040和2512 bp位置出現(xiàn)明顯的條帶（圖1），與目的條帶大小相符，為15-LOX-2基因和pTRE-Tight載體的正確連接準(zhǔn)備好了條件。

將pcDNA3-15-LOX-2和pTRE-Tight載體經(jīng)EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切的目的條帶切膠回收連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐西林抗性（Amp+）的LB培養(yǎng)基平板上挑取白色單個(gè)菌落，振蕩培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（圖2），在pTRETight-15-Lox-2雙酶切后孔帶上可觀察到2040和2512 bp的目的基因片段條帶，表明克隆得到正確的含有目的基因片段的原核表達(dá)質(zhì)粒。

2.2 pTet-On-Advanced、pTRE-Tight-Luc共轉(zhuǎn)染載體比例的篩選

用 LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染體系，在96孔板上用質(zhì)粒pTet-On-Advanced和pTRE-Tight-Luc共轉(zhuǎn)染2個(gè)復(fù)孔細(xì)胞，采用不同的Tet-On/TRE載體比例（1∶1、1∶5、5∶1），結(jié)果顯示1∶1的載體比例經(jīng)DOX誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)活性最高（圖3），誘導(dǎo)倍數(shù)為432（圖4），為15-LOX-2的誘導(dǎo)表達(dá)提供了轉(zhuǎn)染的載體比例依據(jù)。

2.3 DOX誘導(dǎo)pTRE-Tight-15-LOX-2在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 質(zhì)粒EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

圖2 重組質(zhì)粒pTRE-Tight-15-LOX-2雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

為驗(yàn)證pTet-On-Advanced與pTRE-Tight-15-Lox-2共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，DOX對(duì)15-LOX-2的誘導(dǎo)表達(dá)效果，即檢驗(yàn)重組質(zhì)粒pTRE-Tight-15-LOX-2的表達(dá)情況，我們采用上述1∶1的共轉(zhuǎn)染載體比例，在DOX誘導(dǎo)24 h后收集細(xì)胞，用Western印跡檢測了A549細(xì)胞中15-LOX-2的表達(dá)。結(jié)果顯示，DOX誘導(dǎo)24 h后，空白對(duì)照組、未加DOX組均未檢測到15-LOX-2的表達(dá)，而添加DOX組檢測到15-LOX-2的表達(dá)（圖5）。這表明經(jīng)DOX誘導(dǎo)后，15-LOX-2能在肺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且在未加入DOX時(shí)基礎(chǔ)表達(dá)極低。

3 討論

Tet-On Advanced可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)嚴(yán)密、高效的反應(yīng)系統(tǒng)，能在靶細(xì)胞里使目標(biāo)基因按需強(qiáng)烈表達(dá)。四環(huán)素控制的反式作用因子Tet-On Advanced是一個(gè)融合蛋白，由大腸桿菌四環(huán)素反應(yīng)蛋白的突變體結(jié)合于單純皰疹病毒（herpes sim?plex virus，HSV）VP16蛋白的3個(gè)小的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)組成。當(dāng)有誘導(dǎo)劑DOX存在時(shí)，Tet-On Advanced結(jié)合到PTight的四環(huán)素反應(yīng)元件（TREMOD），引起下游目的基因的高水平轉(zhuǎn)錄。

圖3 pTet-On-Advanced和pTRE-Tight-Luc共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后的螢光素酶活性

圖4 pTet-On-Advanced和pTRE-Tight-Luc共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后的螢光素酶誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)

圖5 Western印跡檢測DOX誘導(dǎo)后15-LOX-2的表達(dá)

近年來陸續(xù)有運(yùn)用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行藥物篩選和抗癌機(jī)制及基因治療方面的研究報(bào)道[8-9]。尤其在抗癌藥物作用機(jī)制研究中，某些基因具有抗癌效應(yīng)，給基因的表達(dá)調(diào)控研究帶來了一定的困難。而Tet-On Advanced系統(tǒng)能在需要時(shí)誘導(dǎo)目的基因高效表達(dá)，從而在抗癌效應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控研究方面具有一定的優(yōu)勢。

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類健康。腺癌的惡性程度較鱗狀細(xì)胞癌高，且對(duì)其的診斷是更差的[10-11]。對(duì)腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的較好理解，有助于更好的癌癥治療項(xiàng)目的發(fā)展。A549細(xì)胞是人肺腺癌細(xì)胞，具有非整倍性的特性，同時(shí)還易轉(zhuǎn)移，對(duì)化療藥物不敏感。

對(duì)包括肺腺癌在內(nèi)的肺癌的基因治療是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，有望成為繼手術(shù)治療、化療及放療后的一種新的治療模式。研究表明，15-LOX-2不僅可抑制腫瘤細(xì)胞生長，還可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。實(shí)際上15-LOX-2為表皮型15-LOX，于1997年由Brash等從人的發(fā)根克隆得到，主要表達(dá)于皮膚、前列腺、肺和角膜，主要代謝花生四烯酸產(chǎn)生15-羥二十碳四烯酸（15-S-HETE）。Kelavkar等的研究顯示，15-LOX基因位于染色體17p13.3，緊鄰人p53腫瘤抑制基因。15-LOX基因產(chǎn)物可能是抗炎分子和細(xì)胞膜重塑的調(diào)節(jié)者，也可能是一種潛在的腫瘤抑制分子[12]。有研究者認(rèn)為15-LOX-2在乳腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌中都具有抑癌活性[2-3]，但其對(duì)肺癌尤其是肺腺癌A549細(xì)胞的作用及分子機(jī)制尚不清楚。

我們在基因水平上構(gòu)建了pTRE-Tight-15-Lox-2誘導(dǎo)表達(dá)載體，與調(diào)控載體pTet-On-Ad?vanced共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入DOX后能夠誘導(dǎo)15-LOX-2表達(dá)，且在未加入DOX時(shí)基礎(chǔ)表達(dá)極低（未檢測到）。本研究結(jié)果表明Tet-On Advanced能嚴(yán)密有效地調(diào)控15-LOX-2的表達(dá)，為研究15-LOX-2與肺癌的關(guān)系打下了基礎(chǔ)。

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