倪艷麗，李欣，劉少君

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850

脊髓損傷與修復(fù)反應(yīng)受多種因素影響，是有多種分子參與的復(fù)雜的病理過程，目前其分子機(jī)理仍不明確，因而無法找到有效干預(yù)措施。脊髓損傷與修復(fù)蛋白39（spinal cord injury and regeneration re?lated protein 39，SCIRR39）基因是我們克隆到的在大鼠脊髓損傷及修復(fù)過程中上調(diào)表達(dá)的基因[1]，是大鼠核糖核酸酶抑制因子基因的突變體[2-4]，其編碼的蛋白以前只發(fā)現(xiàn)存在于胞漿內(nèi)，而近年有報(bào)道顯示該蛋白還存在于細(xì)胞核及線粒體中[5]，但功能不詳。為進(jìn)一步研究該蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其他組織中的分布，及其在脊髓損傷修復(fù)過程中可能的作用，我們制備了針對該蛋白的特異性抗體，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與修復(fù)機(jī)理研究提供有效的臨床干預(yù)線索。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性成年日本大耳白兔（體質(zhì)量2.5 kg）購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心；大腸桿菌BL21（DE3）由本室保存；克隆載體pGEM-T/T easy、瓊脂糖、質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；EcoRⅠ、BamHⅠ等常用限制性內(nèi)切酶，DL2000 DNA marker，T4DNA連接酶，LA Taq、Pyrobest DNA 聚合酶，IPTG，X-gal，dNTP均購自TaKaRa公司；Super ScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶、TRIzol試劑購自Invitrogen公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 PCR擴(kuò)增Scirr39基因

從大鼠全橫斷損傷脊髓提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板擴(kuò)增Scirr39基因片段。兩端引物分 別 為 39-ORF-5'（ATGTCTCTGGACATCCAGTC）和 39-ORF-3'（TCAGGAGATGACCCTCAGGGATG GC）。PCR 條件：94℃ 2 min，然后以 94℃ 20 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min 進(jìn) 行 30 個(gè) 循 環(huán) ，72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收后，T-A克隆入pGEM-T easy載體中，將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，以EcoRⅠ酶切鑒定重組克隆后進(jìn)一步測序鑒定，保存含有正確重組載體的菌種。

1.3 pGEX-GST-SCIRR39-C融合表達(dá)載體的構(gòu)建

以構(gòu)建的Scirr39 ORF載體為模板PCR擴(kuò)增SCIRR39-C端抗原表位編碼DNA序列，引物分別為E39-N（CGTGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCG GCGGCGGCAGCGCGGAACTGTGCCAGGGCCCG）和E39-C（CGGGAATTCTCAGCTAATCACGCGCAGGC TCGGTTTATCT），兩端分別引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線序列）及保護(hù)堿基，并在上游引物的5'端引入10個(gè)甘氨酸接頭。PCR條件：94℃ 5 min，然后以 94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min 進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收后，BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切回收目的片段，與經(jīng)相同酶消化的表達(dá)載體pGEX-4T-2連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得表達(dá)載體 pGEX-GST-SCIRR39-C，經(jīng) BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切和測序驗(yàn)證，表明目的基因已插入pGEX-4T-2。

1.4 GST-SCIRR39-C融合蛋白的原核表達(dá)和純化

把pGEX-GST-SCIRR39-C轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3），陽性克隆用LB培養(yǎng)基于37℃振搖過夜，取100 μL菌液加入10 mL氨芐西林抗性的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，D600nm達(dá)0.6～0.8時(shí)加入0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12～16 h，收集菌體，PBS洗3次，超聲波破碎，收集上清，用預(yù)裝谷胱甘肽瓊脂糖凝膠的GST rap FF柱親和純化，再用還原性谷胱甘肽洗脫GST-SCIRR39-C融合蛋白，所有純化操作均在GE Health公司?KTA Prime蛋白純化系統(tǒng)上進(jìn)行，最后用SDS-PAGE鑒定融合蛋白的純化結(jié)果。

1.5 SCIRR39-C抗原表位蛋白的分離

用1 mL注射器，將80 μL凝血酶與920 μL 1×PBS的混合液注入GST rap柱，封閉柱兩端，23～24℃放置16 h；采用1 mL注射器，用3 mL 1×PBS以1 mL/min的流速洗下柱中解離下來的SCIRR39-C蛋白（懸于冰上操作），隨后用10 mL洗脫緩沖液以1 mL/min的流速洗脫柱中的GST蛋白（懸于冰上操作），以評價(jià)凝血酶酶切效率。純化后的SCIRR39-C蛋白經(jīng)冷凍干燥濃縮，以備檢測抗體效價(jià)時(shí)使用。

1.6 抗體制備

取飼養(yǎng)1周、體質(zhì)量為2.5 kg的純種日本大耳白兔，免疫前從耳緣靜脈取正常血清作為對照。將1 mg抗原與等體積弗氏完全佐劑混合直到形成乳濁液，采用背部多點(diǎn)皮下注射；2周后，取1 mg抗原與等體積弗氏不完全佐劑充分混勻，背部多點(diǎn)注射進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫；免疫后7～10 d從耳緣靜脈取血，ELISA測定抗體效價(jià)，若滴度小于1∶1000，進(jìn)一步加強(qiáng)免疫，要求每2周免疫一次，直到抗體效價(jià)達(dá)到所需滴度；到所需滴度后的第10 d從頸動脈采血，采集的血液室溫斜置30 min，移到4℃冰箱待血清析出，收集血清后1000 r/min離心10 min，0.5 mL/支分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 ELISA測定抗體滴度

用pH9.6的包被緩沖液將免疫所用蛋白稀釋至所需濃度（100 ng/100 μL），在酶標(biāo)板每孔中加入100 μL，并將板置于濕盒中，4℃過夜或37℃保溫4 h；用PBS-T洗板3次后每孔加入200 μL封閉液，于37℃保溫1 h，隨后用PBS-T洗板3次；一抗用生理鹽水進(jìn)行 1/10 梯度稀釋，100 μL/孔，4℃過夜，用PBS-T洗板3次，接著進(jìn)行二抗反應(yīng)，37℃保溫2 h，用PBS-T洗板3次；進(jìn)行顯色反應(yīng)，用BIO-RAD 680酶標(biāo)儀測定D492nm值。

1.8 Western印跡檢測抗體特異性

取SCIRR39-C重組抗原表位蛋白進(jìn)行SDSPAGE，采用預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)以便于檢測轉(zhuǎn)移效率。15 V以下恒壓轉(zhuǎn)移45 min，于1%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入制備的一抗Anti-SCIRR39（1∶500）室溫孵育1 h，用0.1%PBST洗3次，各10 min；以封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000），與硝酸纖維素膜一起于室溫共孵育1 h；用0.1%PBST洗3次，各10 min；ECL試劑顯色。

2 結(jié)果

2.1 Scirr39基因的克隆及鑒定

以大鼠全橫斷損傷脊髓的總RNA為模板，加入上下游引物，PCR擴(kuò)增得到特異目的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明擴(kuò)增片段長1386 bp（圖1）。

2.2 GST-SCIRR39-C融合表達(dá)載體的構(gòu)建

為了免疫動物制備抗體，我們將Scirr39編碼區(qū)C端的1077～1383 bp（圖2）克隆到pGEX-4T-2原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑選陽性克隆，經(jīng)過測序保證其序列正確。

2.3 GST-SCIRR39-C融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達(dá)

在30℃、0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)GST-SCIRR39-C融合蛋白。GST相對分子質(zhì)量（Mr）為 26×103，SCIRR39-C為 11.9×103，融合蛋白為37.9×103。圖3顯示表達(dá)的融合蛋白Mr與理論值一致。

圖1 Scirr39基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 SCIRR39-C端抗原表位編碼DNA片段的擴(kuò)增

圖3 SDS-PAGE檢測GST-SCIRR39-C的表達(dá)

2.4 融合蛋白的純化

在GE Health公司?KTA Prime蛋白純化系統(tǒng)上進(jìn)行，圖4為SDS-PAGE檢驗(yàn)純化結(jié)果。

2.5 融合蛋白的酶切

GST-SCIRR39-C融和蛋白經(jīng)凝血酶消化后，SCIRR39-C蛋白流出液及GST洗脫液如圖5所示，主要蛋白條帶Mr分別約為 26×103和11.9×103。

2.6 抗SCIRR39蛋白兔抗血清的ELISA效價(jià)測定

干燥后的融合蛋白溶于0.1 mol/L PBS，終濃度1 mg/mL，采用背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射的方法免疫大耳白兔，多次加強(qiáng)免疫后第10 d抽取血清，用ELISA檢測抗體滴度，以免疫前抽取的兔血清為對照，其效價(jià)達(dá)到1∶104，可以取血收集血清（圖6）。

2.7 Western印跡檢測兔抗血清的特異性

以兔抗血清對原核表達(dá)的SCIRR39-C蛋白進(jìn)行Western印跡檢測，圖7顯示該蛋白條帶可被檢測到，且其相對分子質(zhì)量與預(yù)期的SCIRR39-C一致，說明制備的抗血清結(jié)合性較好。

3 討論

圖4 SDS-PAGE檢測GST-SCIRR39-C的純化

圖5 SDS-PAGE檢測GST-SCIRR39-C融合蛋白凝血酶切結(jié)果

圖6 ELISA檢測抗體效價(jià)

圖7 Western印跡檢測Anti-SCIRR39的抗體特異性

由于SCIRR39是新近發(fā)現(xiàn)的大鼠RNase抑制劑（RNH）的同源蛋白[6-7]，目前尚無針對其的商業(yè)化特異性抗體，而為了研究SCIRR39在神經(jīng)系統(tǒng)的分布及其在脊髓損傷/修復(fù)過程中可能的作用[8-10]，以至其他功能，我們要制備針對其的特異性抗體。為此，我們采用GST融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組SCIRR39。該表達(dá)系統(tǒng)可以高效表達(dá)融合蛋白，且產(chǎn)物易純化，用凝血酶切除GST也比較容易。但由于原核細(xì)胞中缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，以及在重組蛋白表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，且表達(dá)環(huán)境不同于真核細(xì)胞，無法形成正確的次級鍵等原因，故使得表達(dá)的融合蛋白很難折疊成正確的空間構(gòu)象。我們在表達(dá)SCIRR39全長蛋白時(shí)就遇到這方面的重重困難，由于蛋白序列中含有多達(dá)32個(gè)Cys殘基，很可能在表達(dá)過程中發(fā)生二硫鍵錯(cuò)配，使得我們沒有得到目的蛋白。而通過降低誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度等方法也沒有提高蛋白的可溶表達(dá)量，這種極少量的目的蛋白對于抗體制備來說是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因此，我們選擇表達(dá)抗原表位的方法制備抗體。通過抗原表位分析，選擇C端359～461位103個(gè)氨基酸殘基作為SCIRR39的抗原表位，免疫家兔制備多克隆抗體。經(jīng)過對宿主菌的選擇及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，我們將構(gòu)建的重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)；之后用純化的SCIRR39免疫成年日本大耳白兔，得到了針對SCIRR39的多克隆抗體[11]，該兔抗血清的ELISA效價(jià)約為1∶104，表明抗血清具有較好的特異性。SCIRR39重組蛋白多克隆抗體的成功制備，為進(jìn)一步深入研究其生物學(xué)功能提供了良好的工具。

[1]李欣,闕海萍,馬振蓮,等.應(yīng)用錨定消減雜交技術(shù)克隆分析大鼠脊髓原代神經(jīng)元損傷、修復(fù)相關(guān)基因[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2005,30(12):1072-1075.

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