單莉莉，朱婷，王中海

廣東醫(yī)學(xué)院 附屬南山醫(yī)院，廣東 深圳 518052

子宮內(nèi)膜異位癥簡稱內(nèi)異癥，是婦科常見疾病，常導(dǎo)致痛經(jīng)、不孕等癥狀，嚴(yán)重影響女性身心健康。錯(cuò)配修復(fù)基因1（human mutL homolog 1，hMLH1）與錯(cuò)配修復(fù)基因2（human mutS homolog 2，hMSH2）是人類細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（mismatch repair system，MMR）的重要組成基因，它們擔(dān)負(fù)對錯(cuò)配位點(diǎn)的識別和切除的主要功能。我們應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation specific PCR，MSP），檢測了卵巢子宮內(nèi)膜異位癥組織和正常子宮內(nèi)膜中hMLH1、hMSH2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況，并分析了其與內(nèi)異癥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

我院收治的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者23例，所有患者術(shù)前未經(jīng)激素治療，采集異位內(nèi)膜組織；20例在我院行節(jié)育術(shù)、子宮脫垂手術(shù)的患者，所有患者均排除了患有其他器官系統(tǒng)惡性腫瘤的可能，留取正常子宮內(nèi)膜組織。所有標(biāo)本無菌采集后立即置-80℃恒溫冰箱中待用。

1.2 DNA提取

用小量組織基因組DNA抽提試劑盒（購自上海生工公司）提取組織DNA，紫外分光光度計(jì)定量，提取的DNA置-20℃保存。

1.3 hMLH1、hMSH2基因啟動(dòng)子甲基化的檢測

MSP是近年發(fā)展起來的一種特異、靈敏的檢測基因甲基化的技術(shù)。其原理是，利用亞硫酸鹽可使DNA中胞嘧啶（C）脫氨而轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║）的特性，將DNA用亞硫酸鹽處理，未甲基化的胞嘧啶就轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶則不變。

取 1 μg DNA，用 CpGenome DNA Modifica?tion Kit（購自CHEMICON公司）進(jìn)行甲基化修飾，然后以此為模板，分別用hMLH1甲基化引物與非甲基化引物（hMLH1-M、hMLH1-U）和hMSH2甲基化引物與非甲基化引物（hMSH2-M、hMSH2-U）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物由上海生工公司合成，序列見表1）。50 μL PCR反應(yīng)體系（BBI公司提供）包括2×PCR Mas?ter混合液 25 μL（含 3.0 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、0.1 U/μL Taq DNA 聚合酶）、hMLH1-M 或hMSH2-M 1 μL、hMLH1-U 或 hMSH2-U 1 μL、DNA模板（DNA濃度為 0.1～1 μg/μL）1 μL、去離子水1 μL。

hMLH1反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，以95℃變性 45 s、60℃退火 30 s、72℃延伸 30 s循環(huán) 35次，72℃延伸5 min。hMSH2反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，以95℃變性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸40 s循環(huán)35次，72℃延伸7 min。

表1 引物及序列

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.7%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS12.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

用甲基化和未甲基化引物可同時(shí)擴(kuò)增出產(chǎn)物者為部分甲基化，只有甲基化引物擴(kuò)增出產(chǎn)物者為完全甲基化。

2.1 hMLH1基因的MSP結(jié)果

20例正常子宮內(nèi)膜組織中出現(xiàn)了1例部分甲基化，異常甲基化率為5%（1/20）；23例子宮內(nèi)膜異位癥組織中出現(xiàn)了4例部分甲基化和5例完全甲基化，異常甲基化率為39%（9/23）。兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、2。

2.2 hMSH2基因的MSP結(jié)果

20例正常子宮內(nèi)膜組織中出現(xiàn)了1例部分甲基化，異常甲基化率為5%（1/20）；23例子宮內(nèi)膜異位癥組織中出現(xiàn)了2例部分甲基化，異常甲基化率為8%（2/23）。兩者比較，無明顯差異（P＞0.05）。見圖3、4。

3 討論

圖1 子宮內(nèi)膜異位癥hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

圖2 正常子宮內(nèi)膜hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

圖3 子宮內(nèi)膜異位癥hMSH2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

圖4 正常子宮內(nèi)膜hMSH2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜的來源至今尚未闡明，目前闡述發(fā)病機(jī)制的主要學(xué)說包括經(jīng)血逆流學(xué)說、靜脈淋巴播散學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、誘導(dǎo)學(xué)說、干細(xì)胞起源學(xué)說、在位內(nèi)膜決定論等。近年研究認(rèn)為，內(nèi)異癥與糖尿病、高血壓等疾病一樣，是多基因多因素共同作用的結(jié)果，具有復(fù)雜的遺傳特征，也是一種表觀遺傳疾病[1]。

DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（MMR系統(tǒng)）是細(xì)胞內(nèi)在核苷酸水平上糾正復(fù)制錯(cuò)誤的重要手段，可以通過校正新合成DNA鏈中錯(cuò)配的堿基而高效提高正常體細(xì)胞抵御突變的能力，常出現(xiàn)在細(xì)胞增殖過程中，對保持DNA復(fù)制的忠實(shí)性和基因組的穩(wěn)定性起到關(guān)鍵作用[2]。MMR基因的改變使得細(xì)胞在增殖過程中的錯(cuò)誤摻入與缺失不能修復(fù)，表現(xiàn)為整個(gè)基因組不穩(wěn)定，隨機(jī)突變率增高，使一系列靶基因如涉及細(xì)胞生長、分化、凋亡及腫瘤轉(zhuǎn)移等的相關(guān)基因改變，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。DNA甲基化指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的催化下，S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到胞苷嘧啶環(huán)的第5位碳原子上，形成甲基化胞嘧啶，哺乳動(dòng)物中甲基化修飾主要發(fā)生在G/C含量豐富的CpG島區(qū)域。CpG島被甲基化并結(jié)合甲基CpG結(jié)合蛋白（MeCP），使基因關(guān)閉而抑制基因轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化與基因表達(dá)呈反比關(guān)系，甲基化程度增高，則基因表達(dá)降低。研究發(fā)現(xiàn)，在MMR基因中，以hMLH1和hMSH2的功能最為重要，它們擔(dān)負(fù)對錯(cuò)配位點(diǎn)的識別和切除的主要功能。hMLH1位于染色體3p21.3-23，基因組全長58 kb，含2268 bp的開放讀框，有19個(gè)外顯子，編碼756個(gè)氨基酸殘基。hMSH2定位于染色體2p22-21或2p16-15，基因組全長73 kb，含2727 bp的開放讀框，有16個(gè)外顯子，編碼909個(gè)氨基酸殘基。

近年，在多種人類惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)了hMLH1啟動(dòng)子區(qū)域的異常甲基化[3-5]。子宮內(nèi)膜異位癥雖是良性疾病，但卻具有類似腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處侵犯的特點(diǎn)。有學(xué)者利用激光捕獲顯微切割技術(shù)和RT-PCR檢測子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中3種甲基化轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種甲基化轉(zhuǎn)移酶基因均過度表達(dá)，說明在子宮內(nèi)膜異位癥中確實(shí)存在DNA的異常甲基化[6]。在本研究中，我們采用MSP法同時(shí)檢測子宮內(nèi)膜異位癥組織與正常子宮內(nèi)膜組織中hMLH1、hMSH2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況，進(jìn)行比較性研究，結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥組織中hMLH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)生率高于正常子宮內(nèi)膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在正常內(nèi)膜與子宮內(nèi)膜異位病灶之間，hMSH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況沒有顯著區(qū)別。本研究結(jié)果提示，hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可能是子宮內(nèi)膜異位癥的病因之一，而hMSH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化與子宮內(nèi)膜異位癥之間不存在顯著聯(lián)系。

國外已有學(xué)者報(bào)道，異常甲基化的基因可作為一種新的癌癥的生物學(xué)標(biāo)志物[7]。Vaissière等[8]報(bào)道，定量分析特異性基因的甲基化情況并結(jié)合性別可作為識別肺癌的危險(xiǎn)因素。Malekzadeh等[9]報(bào)道，Rb1和Casp-8啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)可作為膀胱癌的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。本研究在DNA水平顯示，與正常子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜異位癥組織存在著hMLH1啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化。那么，在未來，我們能否將hMLH1啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化檢測作為內(nèi)異癥診斷的指標(biāo)之一？能否通過檢測hMLH1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況來預(yù)測內(nèi)異癥的復(fù)發(fā)？本次實(shí)驗(yàn)只是對子宮內(nèi)膜異位癥中hMLH1、hMSH2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的初步研究，我們尚需要大樣本的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證明上述論斷，需要檢測更多的錯(cuò)配修復(fù)基因來尋找其與內(nèi)異癥的關(guān)系。

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