龐美霞，綦菁華，王 芳，黃漫青，王 偉

(1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206;2.石家莊衛(wèi)生學(xué)校，河北石家莊 050061)

豬血是一種可以大量獲得的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的工業(yè)副產(chǎn)品，其中蛋白質(zhì)含量18.9%，比雞蛋高6.2%，比大米高12.7%，因此豬血被人們譽(yù)為“液態(tài)肉”［1］。豬血由血細(xì)胞和血漿兩部分組成，血漿蛋白含量約占全血蛋白含量的25%，血漿蛋白容易制取，可通過(guò)離心、干燥制得，因此被廣泛用于肉類、布丁、香腸等食品中。而血細(xì)胞蛋白—主要是血紅蛋白，由于色澤猩紅，具有腥味和不易消化，應(yīng)用受到限制［2］。

我國(guó)每年的生豬產(chǎn)量居世界第一，占世界生豬產(chǎn)量的一半，豬血資源非常豐富，每年獲得的血量在90萬(wàn)t以上［2］，但目前僅用來(lái)制造飼料用血粉及血豆腐、血餅等附加值較低的產(chǎn)品，因此對(duì)豬血的利用很低。很多豬血被直接排放入環(huán)境中，造成環(huán)境污染。我國(guó)從20世紀(jì)80年代開始研究豬血的綜合利用，目前文獻(xiàn)報(bào)道了利用豬血開發(fā)血紅素、蛋白粉、凝血酶和超氧化物岐化酶(SOD)的研究［3-4］。

血紅素是含鐵卟啉化合物，具有重要的生理功能，應(yīng)用廣泛。目前血紅素的提取方法主要是有機(jī)試劑法，既污染環(huán)境，毒性也大，因此國(guó)內(nèi)外一直在研究新的血紅素提取方法。近年來(lái)，很多人利用酶技術(shù)提取畜禽血液中的血紅素。從豬血中酶法提取血紅素，將會(huì)產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［5］。

1 血紅素、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì)

血紅素是動(dòng)物肌肉和血液中的主要色素，在肌肉中主要以肌紅蛋白(myoglobin，Mb)形式存在，在血液中主要以血紅蛋白(hemoglobin，Hb)形式存在。血紅蛋白是由兩條α－球蛋白多肽鏈和兩條β－球蛋白多肽鏈組成的四聚體，因此具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，由四個(gè)亞基組成。每個(gè)亞基由一條多肽鏈與一個(gè)血紅素相連接，4個(gè)亞基之間由鹽鍵連接。肌紅蛋白是只有三級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，與血紅蛋白各亞基結(jié)構(gòu)極為相似。血紅蛋白和肌紅蛋白均是典型的攜氧蛋白［6］。

血紅素是一種亞鐵卟啉化合物。四個(gè)吡咯環(huán)由四個(gè)α-碳原子通過(guò)四個(gè)次甲基(—CH=)橋相連形成卟吩環(huán)，F(xiàn)e2+位于環(huán)中，與吡咯環(huán)上的氮原子結(jié)合成四個(gè)配位鍵，從而形成亞鐵卟啉環(huán)，血紅素分子式為C34H33FeN4O4，分子量為633.49。亞鐵原子與球蛋白分子組氨酸殘基上的咪唑環(huán)上的氮原子形成第五個(gè)配位鍵，與各種配基的電負(fù)性原子結(jié)合形成第六個(gè)配位鍵。血紅素及血紅蛋白結(jié)構(gòu)見圖1。血紅素為片狀或針狀的紫色結(jié)晶，不溶于水、稀酸、醚、氯仿及丙酮，溶于氫氧化鈉水溶液、熱或氨水中［7，8］。血紅蛋白溶解性好，有很強(qiáng)的乳化能力，并能形成穩(wěn)定的泡沫。

2 血紅素制備工藝

目前工業(yè)中主要利用有機(jī)溶劑法生產(chǎn)血紅素(包括冰醋酸法和酸性丙酮法)［9］。冰醋酸法是血液與冰醋酸及少量NaCl，KCl等共熱得到血紅素結(jié)晶。此法收率低，1升血液只可得3—4 g血紅素結(jié)晶，提取溫度高，蛋白和溶劑難回收［10］。酸性丙酮法是根據(jù)血紅素與珠蛋白在pH3.0附近結(jié)合最疏松的原理分離血紅素的。加入鹽酸丙酮溶液，血紅素與珠蛋白脫離，亞鐵血紅素變成氯化血紅素且溶于酸性丙酮中，珠蛋白變性沉淀。根據(jù)后序工藝不同酸性丙酮法可分為醋酸鈉法、蒸餾法、稀堿抽提法、鞣酸鹽析法［9］。

圖1 只有主鏈骨架而沒有側(cè)鏈的血紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

此外近些年在實(shí)驗(yàn)室還有人用CMC法、表面活性劑法、酶解法等方法制備血紅素。CMC法是利用CMC吸附血紅素與血紅蛋白分離的。表面活性劑法是在鹽酸酸化的血紅蛋白中加入表面活性劑，加熱，氯化血紅素沉淀出來(lái)［9］。利用蛋白酶提取血紅素是最環(huán)保的一種方法。

3 蛋白酶法制備血紅素工藝研究進(jìn)展

3.1 原理及工藝流程

在新鮮血液中添加抗凝劑，離心分離得到紅細(xì)胞，破碎紅細(xì)胞，用各種蛋白酶在其最適條件下將血紅蛋白上的珠蛋白水解，肽鏈斷開，水解液中有血紅素肽、血紅素和肽片段，除去不需要的肽，得到血紅素復(fù)合體。以動(dòng)物血液作原料，將紅細(xì)胞用大量水稀釋，調(diào)pH，用蛋白酶進(jìn)行水解，將珠蛋白和血紅素分離［9，11］，工藝流程見圖 2。

圖2 酶法制備血紅素工藝

3.2 蛋白酶的選擇及血紅素酶法提取工藝研究進(jìn)展

用于水解蛋白質(zhì)的酶按來(lái)源分有三種:植物蛋白酶(如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶)、動(dòng)物蛋白酶(如胰蛋白酶)和微生物蛋白酶。目前在我國(guó)酶法提取血紅素還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。選出成本低廉的蛋白酶，采用最簡(jiǎn)單的方法制備血紅素是研究的熱點(diǎn)。

瞿桂香等［12］研究了4種蛋白酶，以血紅素提取率為考察指標(biāo)，按影響程度從大到小的順序是堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶。張亞娟［11］分別選用6種酶以及復(fù)合酶水解血紅蛋白，然后用三氯乙酸沉淀四肽以上片段，再測(cè)定上清液280 nm下的吸光度值，吸光值大小反應(yīng)蛋白質(zhì)的水解率，通過(guò)此方法確定堿性蛋白酶的水解能力最強(qiáng)，其次是中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，風(fēng)味酶，復(fù)合酶水解效果也較好，但低于堿性蛋白酶。楊錫洪等［13］先加中性蛋白酶，再加風(fēng)味蛋白酶制備了亞鐵血紅素肽。楊萍等［14］用木瓜蛋白酶和AS1398中性蛋白酶復(fù)配生產(chǎn)補(bǔ)血活性肽。張純麗［2］用木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=6∶4制備血紅素肽。

3.3 血紅素純化方法

血紅素純化的方法一般采用有機(jī)溶劑重復(fù)提取法或硅膠柱純化［15，16］，但這些方法生產(chǎn)成本高，且污染環(huán)境?，F(xiàn)在有實(shí)驗(yàn)室研究用超濾，酸化，凝膠層析等方法純化血紅素酶提取液。

周淡宜，徐水祥［17］利用血紅素不溶于水和醋酸的特性，將堿性提取液酸化，血紅素析出，然后經(jīng)過(guò)過(guò)濾、干燥得純品。張亞娟［11］將酶解液用鹽酸調(diào)pH至4.0，4 000 rpm/min離心15分來(lái)純化血紅素，所得粗品純度23%。楊錫洪等［13］將水解產(chǎn)物經(jīng)10 kDa微孔濾膜超濾后，濾過(guò)液再經(jīng)3 kDa濾膜超濾，收集第二次的滯留液，主要得到分子量分布為9982、6918和3951三個(gè)組分，制得亞鐵血紅素與肽的比值為9.92%的富亞鐵血紅素肽。

李艷偉［18］將胰蛋白酶水解的酶解液反復(fù)超濾后，通過(guò)Sephadex G－25凝膠層析、陽(yáng)離子交換層析制得抗菌肽。

3.4 前處理——破碎紅細(xì)胞

酶解前必須破碎紅細(xì)胞。目前已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎方法，主要分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。機(jī)械法有高壓勻漿破碎法、高速攪拌珠研磨破碎法、超聲波破碎法等;非機(jī)械法主要有滲透壓沖擊破碎法、凍融破碎法、酶溶破碎法、利用酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑的化學(xué)破碎法。豬血酶法提取血紅素目前主要是加水溶脹紅細(xì)胞和超聲波破胞。

楊錫洪等［13］加紅細(xì)胞3倍體積的蒸餾水，攪拌下溶脹破壁。真空脫氣，避光條件下60℃加熱30 min，3 000 r/min離心15 min，去除變性的雜蛋白等，得到血紅蛋白溶液。劉振榮等［19］首次將超聲波技術(shù)用于丙酮法提取氯化血紅素，加水量為離心后紅細(xì)胞體積的1/5，超聲波溶血時(shí)間為10 min，提取時(shí)間為15 min。王長(zhǎng)瑞等［20］用超聲波酶法提取血紅素，最佳工藝條件為紅細(xì)胞與水的比例5∶1，破碎功率 185.34 W，時(shí)間8.76 min。

3.5 酶解中注意的問(wèn)題——亞鐵離子的保護(hù)

酶解中血紅素亞鐵離子易被氧化成高鐵離子［21］，血紅蛋白液由紅色變?yōu)楹稚?。因此，在酶解時(shí)要加入適量的抗氧化劑來(lái)保護(hù)亞鐵血紅素，從而得到色澤理想的亞鐵血紅素肽。李芳等［22］研究乙氧喹和Vc對(duì)血紅素標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化效果，結(jié)果表明乙氧喹在實(shí)驗(yàn)初期對(duì)亞鐵血紅素有良好的抗氧化性能，而Vc則具有持久的抗氧化性能，Vc/乙氧喹復(fù)合型抗氧化劑具有明顯優(yōu)于單一型抗氧化劑的抗氧化性能。楊錫洪等［13］酶解后，經(jīng)過(guò)真空脫氣、充氮，并添加茶多酚和異抗壞血酸鈉保護(hù)亞鐵離子。

4 酶解肽的功能及應(yīng)用

4.1 血紅素肽的功能及應(yīng)用［23］

血紅素鐵可預(yù)防和改善營(yíng)養(yǎng)性貧血。因此可將血紅素肽添加到餅干、巧克力、糖果、面包、醬油等食品中作營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑。

血紅素也是一種天然色素，添加在肉類食品中可作發(fā)色劑。在火腿、灌腸、午餐肉等肉制品中加入血紅素肽，可取代亞硝酸鹽及人工合成色素，使肉制品產(chǎn)生鮮艷紅色，增加食品的安全性。

在醫(yī)藥工業(yè)，血紅素是半合成法制備膽紅素的前體，而膽紅素是制備人工牛黃和抗癌藥的重要原料。

4.2 血紅蛋白多肽的功能

目前從食品蛋白質(zhì)的酶解物中發(fā)現(xiàn)了一些小分子肽，包括抗高血壓肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗血栓肽、抗菌肽、抗癌肽，活性肽的開發(fā)是功能性食品研究最活躍的領(lǐng)域之一。Kazue等酶解豬血紅蛋白得到了4種具有抑制ACE活性，降血壓的活性肽［24］。張艷梅等將血紅蛋白酶解液脫色，經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析純化，提取到了抗菌肽。方俊等［25］試驗(yàn)結(jié)果表明豬血多肽具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

5 結(jié)束語(yǔ)

酶解法制備血紅素是血紅素提取的發(fā)展方向，但是此法尚未成熟，血紅素的氧化以及溶解性問(wèn)題需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。篩選出成本低廉的蛋白酶，建立簡(jiǎn)單易行，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)的血紅素提取、純化方法，尋找合適的抗氧化劑或還原劑以及改善其溶解性等是需要解決的問(wèn)題。

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