張 瑩，黃哲甦

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

復方氨基酸注射液(3AA)為復方制劑，由纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸配制而成，可用于各種原因引起的肝性腦病、重癥肝炎以及肝硬化、慢性活動性肝炎。亦可用于肝膽外科手術前后。該品種現(xiàn)收載于衛(wèi)生部藥品標準(二部)第六冊(生化藥品第一分冊)中，國外藥典未見收載。原質量標準中含量測定僅規(guī)定用適宜的氨基酸分析儀或高效液相色譜儀測定氨基酸的含量，因目前國內使用氨基酸分析儀分析該品種的情況較少，多數(shù)情況下使用柱前衍生高效液相色譜法進行測定，且柱前衍生法可采用幾種不同的方法，如:PITC、DNFB、AQC等方法，不同的方法需要制備合適的對照品溶液和供試品溶液的濃度，以及采用不同的衍生試劑等?？紤]到原標準檢驗方法的可操作性較差，對樣品質量的仲裁帶來一定的難度，因此本文采用異硫氰酸苯酯柱前衍生化高效液相色譜法測定復方氨基酸注射液(3AA)的含量［1］，該方法具有準確、快速和靈敏度高等優(yōu)點。

1 儀器與試劑

Agilent 1100液相色譜儀。復方氨基酸注射液(3AA)由天津天安藥業(yè)股份有限公司提供(批號201007152、200906206、201002221)。對照品纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸及正亮氨酸(批號均為1406424－200805)均購自中國藥品生物制品檢定所。無水醋酸鈉(天津市文達稀貴試劑化工廠)為分析純，異硫氰酸苯酯為化學純，乙腈為色譜純。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm);流速:1.0 ml/min;柱溫:40 ℃;檢測波長:254 nm，各種氨基酸的理論板數(shù)均大于20 000，分離度均大于2.0。流動相:A為0.1 mol/L醋酸鈉溶液(pH 6.5)－乙腈(93∶7);B為乙腈－水(80∶20)，梯度洗脫程序見表1。

2.2 溶液制備

2.2.1 內標溶液 取正亮氨酸適量，加水溶解并稀釋制成每1 ml中約含0.8 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取纈氨酸對照品約50 mg、亮氨酸對照品約65 mg、異亮氨酸對照品約50 mg，置同一250 ml量瓶中，加水適量，60℃水浴加熱溶解，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻;精密量取5 m l，置10 ml量瓶中，精密加入內標溶液2 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 供試品溶液 精密量取本品2 ml，置50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，精密加入內標溶液2 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 衍生和測定方法 精密量取對照品溶液和供試品溶液各2 ml，分別置具塞試管中，精密加入1 mol/L三乙胺溶液－乙腈(14∶86)1 ml，0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液1 ml，搖勻，在50℃水浴中反應45 min，取出，放冷;再分別精密加入正己烷1 ml，搖勻，放置30 min后(溶液至澄清)，取澄清的下層液各2 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按內標法以峰面積計算含量，見圖1。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜圖

2.4 線性關系考查 精密稱取纈氨酸對照品約100 mg、亮氨酸對照品約130 mg、異亮氨酸對照品約100 mg，置同一250 ml量瓶中，加水適量，60℃水浴加熱溶解，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液;分別精密量取對照品貯備液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml置10 ml量瓶中，精密加入內標溶液2 ml，用水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液2 m l進行衍生，按上述色譜條件測定峰面積，結果表明:纈氨酸在濃度為19.942 ～159.536 μg/ml范圍內峰面積與其呈線性關系，線性方程為:Y=－28.0+7.329 X(r=0.9995);亮氨酸在濃度為 26.176 ～ 209.408 μg/ml范圍內峰面積與其呈線性關系，線性方程為:Y= －41.52+6.877 X(r=0.9998);異亮氨酸在濃度為19.794 ～158.352 μg/ml范圍內峰面積與其呈線性關系，線性方程為:Y= －1.70+6.797 X(r=0.9998)。

2.5 穩(wěn)定性考查 取衍生后的供試品溶液，放置0、1、2、3、4、6 和 24 h 分別進行測定，結果亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸峰面積的RSD值分別為0.56%、0.73%和0.31%。表明供試品溶液中亮氨酸、纈氨酸和異亮氨在24 h內均穩(wěn)定。

2.6 重復性考查 取同一批號(200906206)樣品6份，按照上述方法分別進行測定。結果樣品中亮氨酸平均含量為99.3%，RSD為0.87%;纈氨酸平均含量為99.1%，RSD為 0.96%;異亮氨酸平均含量為97.9%，RSD 為 0.66%。

2.7 回收率考查 分別稱取亮氨酸對照品約52、65和80 mg，纈氨酸和異亮氨酸對照品約40、50和60 mg各3份置250 ml量瓶中，加水適量，60℃水浴加熱溶解，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻;精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，精密加入內標溶液2 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，照含量測定方法進行衍生和測定，亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸平均回收率分別為:99.6%(RSD 為 0.43)、98.5%(RSD 為 0.52)和 99.2%(RSD為 0.49)。見表 2。

表2 回收率試驗結果

2.8 樣品的測定 取3個批號的樣品照上述方法測定，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 在衍生化時曾用較低濃度的異硫氰酸苯酯乙腈溶液，結果衍生物峰面積較小，而濃度過高又會產生其他的衍生物，因此選擇0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液為適當?shù)臐舛冗M行衍生。

3.2 本文建立的方法操作簡單，結果準確，有較高的靈敏度，可用于復方氨基酸注射液(3AA)的含量測定。

1 楊昭鵬，曾文珊，楊曉暉，等.腦蛋白水解物注射液的質量標準(Ⅱ)［J］.藥物分析雜志，2003，23(2):106