北京市藥品檢驗所（100035）王似錦 劉文杰 牛振東 江志杰 張光華 高春

參苓白術顆粒由參苓白術散發(fā)展而來，后者為經(jīng)典方，出自《太平惠民和劑局方》，是在四君子湯的基礎上加山藥、蓮子、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗而成。功能主治為補脾胃，益肺氣。用于脾胃虛弱，食少便溏，氣短咳嗽，肢倦乏力[1]。2009年將參苓白術顆粒收載入《國家基本藥物目錄》。

中藥口服制劑由于其原料是中藥材和中藥飲片，大部分來源是植物根、莖、葉或全草，極易受到微生物的污染，如果生產(chǎn)和加工控制不利，則會導致成品的微生物污染問題，最終有可能會影響藥品質(zhì)量，危害患者的健康[1]。因此，《中國藥典》2010年版一部[2]附錄制劑通則中規(guī)定，中藥顆粒劑應進行微生物限度檢查。本文對來自全國3個生產(chǎn)廠家54個批次的參苓白術顆粒進行微生物方法學驗證，建立了微生物限度檢查法，進行了微生物限度檢查，并對檢驗結果進行了分析討論。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DL-CJ-2ND型超級潔凈工作臺（北京東聯(lián)儀器制造有限公司）；HFsafe-1500生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司），生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 樣品 本試驗所用樣品來自3個生產(chǎn)廠家54個批次，詳細信息見附表2。

1.3 培養(yǎng)基和稀釋液 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，均按照《中國藥典》2010年版一部附錄[2]要求配制，滅菌。稀釋液：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。按照《中國藥典》2010年版一部附錄[2]要求配制，滅菌。

1.4 菌種及菌液制備 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]均購自中國食品藥品檢定研究院。按照《中國藥典》2010年版一部附錄[2]要求配制菌液。

2 方法

2.1 供試液的制備 取本品10g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖，制成1∶10的供試液。

2.2 細菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)驗證方法

2.2.1 菌液組 分別取“1.4”中的菌液1mL，注入平皿中，加入培養(yǎng)基，測定菌液中的菌落數(shù)，結果為a。

2.2.2 樣品對照組 取“2.1”中的1∶10的供試液1mL注入平皿中，加入培養(yǎng)基，測定樣品中的菌落數(shù)，結果為b。

2.2.3 驗證組 取“2.1”中的1∶10的供試液1mL和“1.4”中的菌液1mL分別注入同一平皿中，加入培養(yǎng)基，測定菌落數(shù)，結果為c。

2.2.4 稀釋劑對照組 取“2.1”中的稀釋劑1mL和“1.4”中的菌液1mL分別注入同一平皿中，加入培養(yǎng)基，測定菌落數(shù)，結果為d。

附表1 參苓白術顆粒微生物限度檢查驗證各菌的回收率（%）

附表2 參苓白術顆粒微生物限度檢查結果

據(jù)《中國藥典》2010版一部附錄[2]，若R2≥70%，而且R1≥70%，可認為該稀釋液制備方法和計數(shù)方法可用于該樣品的菌落計數(shù)。若R2＜70%則表明該稀釋液本身有抑菌作用，該稀釋液不可用于菌落計數(shù)。若R2≥70%，而且R1＜70%，可認為該稀釋液制備方法和計數(shù)方法不能用于該樣品的菌落計數(shù)。若使用藥典收載的稀釋液，稀釋劑對照組可不進行試驗。

2.4 微生物限度檢查 按照微生物方法學驗證所建立的微生物限度檢查法進行，并對結果進行分析討論。

3 結果

3.1 細菌計數(shù)方法學驗證結果 分別選取了3個生產(chǎn)廠家的各2批產(chǎn)品，按照2.2進行微生物方法學驗證，結果見附表1，采用常規(guī)注皿法，也就是1∶10的供試液，1mL/皿的方法進行驗證試驗，5種驗證菌株的回收率達到了70%以上，滿足藥典的要求。因此，細菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)應采用該方法進行。

3.2 霉菌和酵母菌計數(shù)、大腸埃希菌檢查和大腸菌群檢查方法學驗證結果 取1∶10的供試液10mL，置膽鹽乳糖培養(yǎng)基100mL中，陽性對照菌生長良好，此方法可行。

來自3個廠家的樣品，其中來自北京漢典制藥有限公司生產(chǎn)的參苓白術顆粒的生產(chǎn)工藝含有中藥原粉，因此需要進行大腸菌群檢查。其驗證結果為，取含10mL的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1mL，陽性對照菌生長良好，此方法可行。

3.3 微生物限度檢查結果分析 54個批次的參苓白術顆粒微生物限度檢驗結果見附表2。其中，霉菌和酵母菌數(shù)有1批的結果是15cfu/g，其余均為＜10cfu/g，大腸埃希菌檢查均為1g中未檢出，只有北京漢典的產(chǎn)品需要進行大腸菌群檢查，其結果均為＜10個/g。

對54個批次樣品的細菌數(shù)結果進行了統(tǒng)計，結果顯示，細菌數(shù)小于100cfu/g的檢品占總數(shù)的88.89%，大于100cfu/g小于1000cfu/g的占11.11%。沒有超過1000cfu/g的批次。54批次的參苓白術顆粒的微生物限度檢查結果統(tǒng)計為54個批次均符合規(guī)定，合格率為100%。

54個批次的參苓白術顆粒按照生產(chǎn)廠家進行分類，并分別按照細菌數(shù)x≤10，10＜x≤100，100＜x≤1000的批次數(shù)進行評價，結果見附表3。由云南騰沖生產(chǎn)的產(chǎn)品占總檢品數(shù)的44%，是抽取最多的一個生產(chǎn)廠家。與其他兩個企業(yè)相比，北京漢典生產(chǎn)的參苓白術顆粒細菌數(shù)小于10的只有1批，其余均大于10，這也許是由于企業(yè)所采用的工藝與其他兩家企業(yè)不同，其產(chǎn)品中含有中藥原粉，按照《中國藥典》的要求，應該進行大腸菌群檢查，并且細菌數(shù)的限值是10000cfu/g。

4 結論

對3個生產(chǎn)廠家的6批參苓白術顆粒進行微生物限度方法學驗證試驗表明，細菌計數(shù)、霉菌和酵母菌計數(shù)，采用1∶10的供試液1mL注皿。大腸埃希菌檢查和大腸菌群檢查均采用常規(guī)法即可。按照上述方法進行微生物限度檢查，結果表明，來自3個廠家54個批次的參苓白術顆粒的微生物限度均符合規(guī)定，結果較為滿意。

附表3 參苓白術顆粒細菌數(shù)分布表